蛋白质组学在糖尿病中的应用

曹凯淇

·综述·

蛋白质组学在糖尿病中的应用

曹凯淇

糖尿病是人类慢性病之一，是目前世界范围内继肿瘤、心血管疾病后的第三位严重危害人类健康的非传染性疾病。糖尿病长期的代谢紊乱常常引起多个系统的损伤，可导致心、眼、肾、神经和血管等器官组织的慢性进行性改变或者功能减退及衰竭。及时、早期诊断治疗糖尿病可以有效地控制血糖水平及防止并发症的发生。随着人类基因组计划的完成，分子生物的研究领域已转移到蛋白质组学的研究。蛋白质组学是全球评价蛋白表达的有力工具，尚未广泛地用于糖尿病的研究。本文对照糖尿病和正常组织间的蛋白质表达谱，发现有利于糖尿病及其并发症的新的研究靶点，对糖尿病及其并发症发病机制的蛋白质组学研究技术进行了概括介绍。

糖尿病；蛋白质组学；应用

1 前言

糖尿病是严重危害人类健康的疾病之一，WTO认为到2025年世界上约有3.3亿糖尿病患者。目前我国已取代印度，成为全球糖尿病第一大国，并且仍以每年超过120万人的速度增加，已成为糖尿病发病的“重灾区”。患者主要以2型糖尿病为主，占90%～95%[1]。虽然对糖尿病的发病机制已经做了很大的努力，但糖尿病及其并发症背后的发病机制仍未明确。自从研究者们通过识别和量化糖尿病患者及对照组的组织、细胞或细胞器中蛋白质的差异表达，蛋白质组学越来越受到欢迎。现今，蛋白质组学的飞速发展为糖尿病及其并发症的发现提供了有力的条件，可以有效的筛选和发现生物标志物，对糖尿病及其并发症的鉴定和治疗学的新方向发挥了有效的作用。本文概述了近年来对糖尿病及其并发症的蛋白质组学研究，应用各种蛋白质组学技术方法，找到糖尿病相关蛋白质标志物。

2 蛋白质组学技术的发展

蛋白质组(proteome)一词，来源于蛋白质(protein)与基因组(genome)两个词的杂合。这一概念是由澳大利亚学者Wilkins和Willions等人于1994年提出，是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测。包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质间的相互作用，在蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生理、生化过程及疾病的生理过程等。可见，蛋白质组学就是以细胞或组织不同时间、环境的所有蛋白质为研究对象，从整体上研究蛋白质的种类、相互作用以及功能结构的学问。

蛋白质组学大致可以分为基于胶的差异分析技术及非胶差异分析技术，前者主要包括双向凝胶电泳、荧光双向差异凝胶电泳等，后者包括多维液相色谱、稳定同位素特征标签生物质谱、蛋白质芯片技术和表面增强激光解析电离分析时间质谱技术等[2]。

3 蛋白质组学技术对糖尿病的应用

随着我国人口老龄化的加剧和人们生活方式的改变，2型糖尿病的患病率不断升高，因其他疾病必须接受手术治疗的糖尿病患者也日渐增多。

Cabre等[3]在研究糖尿病患者中Apo多形态与高血脂的关联中发现，2型糖尿病患者中TC杂合子血浆Apo A5水平及富含TG的脂蛋白浓度是TT纯合子的两倍，提示2型糖尿病患者Apo A5-1131T＞C基因型多态性影响Apo A5的功能。

研究表明胰腺癌也许会导致糖尿病的发生。Wang等[4]旨在识别这些有可能与胰腺癌诱导糖尿病的相关蛋白质。他们利用相对和绝对定量(i-TRAQ)加上二维液体色谱，用质谱法比较胰腺癌患者组织中与糖尿病相关或无关的蛋白质表达，及相邻非肿瘤组织中有无糖尿病相关的蛋白。S100钙结合蛋白129和乙醛脱氢酶2家族被选择用来验证蛋白质免疫印迹和免疫组化结果。对胰腺癌相关蛋白质的识别，以便更好理解和进一步探索胰腺癌相关蛋白质的病因和病机。

Kim[5]团队专注于2型糖尿病的胰岛素抵抗的肝脏、肌肉和脂肪组织的结果。他们使用蛋白质组学和生物信息学的方法，以确定新的肝细胞相关的膜蛋白、肝脏胰岛素抵抗、脂肪肝及2型糖尿病的发展。使用FT-ICR-MS技术，确定了在正常和2型糖尿病db/db小鼠肝脏中95种显著差异表达的蛋白质，这些蛋白主要参与能量代谢途径，分子运输和蜂窝信号，而这些中的大多数以前并没有用于糖尿病的研究中。生物信息学分析显示，16个蛋白质可能与肝脏中胰岛素信号的调节有关。他们也许可以作为有效的诊断标志物和(或)治疗方法。

Zhang等[6]使用全球液相色谱-质谱联用(LC-MS)蛋白分析技术，确定了24种血清蛋白在1型糖尿病患者和健康对照组之间存在着差异。从功能上，这些蛋白质代表先天免疫反应，激活补体级联，炎症反应和凝血等。16肽具有很好的鉴别力，血小板碱性蛋白肽和C1抑制剂具有100%敏感性和100%特异性。这些生物标志物可以将1型糖尿病与健康对照组和2型糖尿病区分开。充分显示了先天免疫反应与1型糖尿病的发展存在某种关联。

1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，其特征是在胰岛β细胞中存在自身抗体。然而，高达2%～5%患有1型糖尿病患者中已知抗体阴性，这表明1型糖尿病患者中自身抗原面板并不完整。为了确定新的1型糖尿病自身抗原，Massa O等[7]采用荧光免疫和2-DE技术对临床诊断为1型糖尿病且自身抗体阴性的受试者血清进行鉴别，其中有111种蛋白质质谱被识别。在目前的工作中，他们精心选择了少数自身免疫抗体和基因均阴性的患者，在胰岛β细胞提取以确定新的候选1型糖尿病自身抗体。

为了在尿液中发现独特的分子特征，证明其与1型糖尿病的发展过程有关，Soggiu A等[8]对1型糖尿病患者和正常对照组微量白蛋白进行对比分析，利用高分辨率二维凝胶电泳分离和MALDI-TOF-MS、LC-MS蛋白质分离技术，对1型糖尿病患者和对照组尿液进行研究。结果发现，1型糖尿病患者和对照组间几种蛋白质存在表达差异，特别是5种蛋白下调和4种蛋白上调。低表达的蛋白分别为Tamm-Horsfall尿糖蛋白、载脂蛋白A、载脂蛋白E、α2-巯基蛋白酶抑制剂、人类补体调节蛋白CD59；同时较高表达的有α1微球蛋白、锌α2糖蛋白、α1β糖蛋白、视黄醇结合蛋白等4种。这些差异始终存在于1型糖尿病患者与健康对照组中。此外，这些蛋白还与糖化血红蛋白有关。这项研究提供了新的见解：尿蛋白可作为1型糖尿病蛋白质分子机制的潜在的预后标志物。

4 蛋白质组学在糖尿病并发症中的应用

糖尿病可影响心脏、血管、肾、眼等多系统组织，伴随或引发多种急性或慢性并发症，损害健康甚至危害到生命。如：DKA、糖尿病非酮症性高渗综合征、乳酸性酸中毒等急性并发症，以及足病、肾病(肾衰竭、尿毒症)、眼病、脑病、心脏病、皮肤病等慢性并发症。英国前瞻性糖尿病研究表明，新诊断的2型糖尿病中约一半已有血管并发症[9]。

蛋白质组学方法能够更好地了解糖尿病并发症的病理生理。鉴于此，Bhonsle HS等[10]在糖尿病患者血浆样本的差异蛋白表达蛋白质组学和免疫印迹分析相结合的研究，双向凝胶电泳和液相色谱-质谱联用显示差异表达的蛋白质，包括纤维蛋白原，结合珠蛋白的上调和下调的维生素D结合蛋白、α1抗胰蛋白酶、甲状腺素运载蛋白和载脂蛋白A，在糖尿病和健康对照组患者血清中表达有差异。在这些蛋白中，Apo A1下调在糖尿病控制不佳组中表现尤为突出。因此，Apo A1的下调可作为糖尿病并发症早期预测指标。

4.1 糖尿病肾脏疾病 糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病最常见、最严重的微血管慢性并发症，发病率逐年增高，已成为危害人类健康的重大疾病。在欧美国家，糖尿病肾病也是终末期肾病(End-stage renal disease，ESRD)的最常见病因，约占全部ESRD病例的44%。DKD起病隐匿，临床上早期诊断糖尿病肾脏疾病存在较大困难。肾穿刺活检术创伤大，并发症多，且费用较高，患者难以承受，而尿液中富含肾脏病变信息，取材简单，无创伤。姜洪娟[11]利用双向凝胶电泳和荧光差异凝胶电泳技术对2型糖尿病尿液标本进行比较蛋白质组学分析。筛选糖尿病肾脏疾病患者尿液中的差异表达蛋白，通过2-DE和2D-DIGE/MS两种蛋白质组学方法，均被鉴定出来的6种蛋白分别是：上皮细胞钙粘蛋白、血清白蛋白、锌α2糖蛋白、α1酸性糖蛋白、视黄醇结合蛋白、尿调节素。这些差异蛋白的识别为糖尿病肾病的早期诊断研究提供了候选标志物，有助于DKD早期诊断和发病机制的深入探索。

Zurbig等[12]认为尿蛋白组分析技术可以作为预测糖尿病肾病的一种工具，毛细血管电泳耦合质谱用于分析尿中低分子量蛋白质组。收集1型和2型糖尿病患者尿液标本，这些标本事前用产生慢性肾脏疾病的生物标志物进行分类，进行长达5年的尿白蛋白追踪检测。对每个尿慢性肾脏疾病生物标志物进行了统计分析，并描述它对于将来诊断糖尿病肾病的可能性。与3～5年之前的数据相比，胶原蛋白碎片显著改变。在白蛋白开始增加之前，胶原蛋白碎片就开始减少了。通过检测相关胶原蛋白碎片，尿蛋白质组学能够在早期阶段非侵入性评估糖尿病肾病风险。

Wu等[13]目前是利用蛋白质芯片技术对2型糖尿病患者的尿蛋白质组学进行分析，去寻找新型的潜在生物标志物来对2型糖尿病肾病进行早期诊断。所用方法是采集95例分别来自2型糖尿病患者及健康对照组的尿微量白蛋白进行SELDI-TOF-MS技术分析。结合生物信息学工具，利用蛋白质芯片技术获得超过300个从1～80 kDa的蛋白质或肽的结果。其中40个m/z从2 008.78～79 176.55 Da在2型糖尿病与对照组间存在显著差别。2 797.03、4 545.77、4 984.03和9 083.71 Da的蛋白质被选择作为2型糖尿病患者潜在生物标志物，其敏感性达88%，特异性达97.6%。结论：蛋白质芯片技术可以帮助发现新的生物标志物并可提供一种新的非侵入性工具用于早期诊断2型糖尿病。

Zhang等[14]旨在利用蛋白质组学技术识别和分析参与糖尿病肾病发展的新的蛋白质。经过分析表明，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的合成酶2(HMGCS2)─生酮作用的关键酶，在2型糖尿病db/db小鼠肾脏增加了4倍。免疫组化、免疫荧光、实时PCR研究进一步证明，HMGCS2在db/db小鼠在肾小球中高度表达，对照组中低度表达。总之，这些研究表明，糖尿病患者肾脏表现出多余的酮活动增加与HMGCS2表达有关，糖尿病肾病中酮体生成的增加可能是其发病的一种新的机制。

4.2 糖尿病心血管疾病 糖尿病患者常发展为高血压和动脉粥样硬化导致心血管疾病。然而有些糖尿病患者无高血压和冠状动脉疾病，而发展为心力衰竭的过程称为糖尿病性心肌病。根皮疳是一种有效的治疗糖尿病的氧化剂，但对其糖尿病心肌病的心脏保护作用知之甚少。Cai等[15]在这项研究中，调查了db/db小鼠糖尿病心肌病的根皮疳保护作用。发现，根皮疳能显著减少体重增加和血清空腹血糖水平(FBG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、晚期糖化终产物(AGEs)，形态学观察表明，经根皮疳治疗后正常心脏结构能够更好地保护。使用相对和绝对定量蛋白质组学，可以确定，根皮疳可能防止糖尿病心肌病的发展。根皮疳用于治疗糖尿病性心肌病可能是一种新的治疗方法。

Ares等[16]对于糖尿病和高血压对心脏的潜在协同作用表现出了极大的兴趣，尤其是对蛋白质的病理表型和相关的肥大反应。他们培养正常和自发性高血压小鼠，22周后对1型糖尿病、自发性高血压(SHR)、自发性高血压/1型糖尿病小鼠等使用蛋白质组学方法进行研究。蛋白质组学发现，长期1型糖尿病、自发性高血压、自发性高血压/1型糖尿病小鼠表现出24.53和53改变蛋白分别在不同心肌。1型糖尿病心肌表明细胞凋亡和细胞复杂蛋白的过度表达，抗凋亡和线粒体代谢酶下调。虽然关键的β-氧化酶并没有激活1型糖尿病和高血压性心肌病，但过氧化物酶增殖物激活受体α(PPARα)可能激活其他的反应。在这方面，PPARα刺激减少了如膜联蛋白-Ⅴ在高糖和血管紧张素Ⅱ诱导了心肌细胞的肥大和肥厚因素。因此，PPARα的激活能够反应高血压、糖尿病心肌病的代谢转移，凋亡增生性代偿性反应。

Essop等[17]认为线粒体功能受损，可能会导致2型糖尿病/胰岛素抵抗患者细胞收缩功能障碍。因此，他们致力于确定肥胖的2型糖尿病小鼠模型中线粒体蛋白质组的改变。利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱及Mascot软件等得出结论：细胞色素C还原酶、核心蛋白1和电子转移核黄素蛋白亚型α-肽水平发生改变。此外，还发现肥胖受试者心脏的收缩蛋白协调下降，即α-平滑肌肌动蛋白、α-心肌肌动蛋白、肌球蛋白重链α和肌球蛋白结合蛋白C。结论：心脏收缩蛋白的下调可能与糖尿病小鼠的心脏收缩功能障碍有关。

4.3 糖尿病视网膜病变 Takahashi等[18]应用差异蛋白质组分析使用iTRAQ技术在2型糖尿病小鼠的相关血清蛋白中发现，人类的同系物SERPINA3增加了视网膜微血管内皮细胞渗透性。这也许是糖尿病和(或)糖尿病视网膜病变的发病机制。有了这些鉴别蛋白，可以提供更有价值的线索去理解糖尿病及并发症的发病机制。

5 妊娠期糖尿病

妊娠合并糖尿病作为产科常见孕期合并症之一，是指妊娠期出现的糖尿病异常。国外报道显示，妊娠合并糖尿病发病率高达5%，而我国筛查检出率只接近3%[19-20]。妊娠合并糖尿病对于母婴均有严重不利的影响，其临床治疗越来越受到国际医学界的关注[21]。临床报道显示妊娠合并糖尿病产妇母婴并发症发病率及病死率明显高于正常健康产妇，特别是妊娠期未早期发现并进行有效血糖控制者[22]。围产期死亡率极高。有报道提示血糖水平与早期子痫发生率呈正相关[23]。故做好临床妊娠合并糖尿病筛查，早期诊断、早期治疗，有效控制血糖水平，对于改善母婴预后具有重要作用。

Kim等[24]设计研究的目的是确定蛋白质的生物标志物进以预测妊娠期糖尿病(GDM)的后期发展。运用表面增强激光解吸/电离飞行时间(SELDI-TOF-MS)进行蛋白质组学分析，得到结论如下：三个峰(9 122、9 412、9 701 Da)增加，被认为与载脂蛋白CⅢ亚型(17 105 Da峰值极度下降)相匹配。ELISA实验同样证实，GDM的妇女载脂蛋白CⅢ确实比对照组有着显著较高水平。他们的数据表明，妊娠期糖尿病妇女母体内在16～20周时已经存在生物标志物。

6 前景

蛋白质组学研究是近年兴起的研究各方面疾病的最前沿领域和热点之一，为临床糖尿病的研究提供了强有力的工具，展现出广阔的应用前景[25]。但是相对基因组研究，它还处于初级阶段，目前还难以实现鉴定细胞和组织的每一个蛋白质，如极酸、极碱、低丰度、难溶性蛋白质以及低拷贝数蛋白等，还未找到最佳的方法来分离；小分子蛋白检测困难；重复性也还不够；对于糖尿病与正常组织或细胞的差异分析，也往往缺少适合的正常组织和细胞作为对照。

总之，随着蛋白质组学研究的不断深入，样本处理技术、蛋白质组分离技术、质谱技术及生物信息学的不断发展，蛋白质组学例临床应用越来越近，必将在糖尿病及其并发症等疾病方面发挥巨大作用。

[1]ColeAR，Astellb A，GreenaC，etal.Molecularconnexions between dementia and diabetes[J].Neuroscience and biobehavioral reviews，2007，31(7)：1046-1063.

[2]廖晓东，毛伟敏.差异蛋白质组学在肺癌诊断及个体化治疗中的研究进展[J].肿瘤学杂志，2009(3)：248-252.

[3]Cabre A，I Lzaro I，Girona J，et al.The APOA5-1131 T＞C variant enhances the association between RBP4 and hyPertrig Iyceridemia in diabetes[J].Nutretab Cardiovasc Diss，2010，20(4)：243-248.

[4]Wan-Sheng Wang，Ling-xiao Liu，Xiao-Hui Liu，et al.Identification of proteins implicated in the development of pancreatic cancer-associated diabetes mellitus by iTRAQ-based quantitative proteomics[J].Journal of proteomics，2013，84(12)：52-60.

[5]Kim GH，Park EC，Yun Y，et al.Proteomic and bioinformatic analysis of membrane proteome in type 2 diabetic mouse liver[J].Protemics，2013，13(7)：1164-1179.

[6]Zhang Q，Fillmore TL，Schepmoes AA，etal.Serum proteomics reveals systemic dysregulation of innate immunity in type 1 diabetes[J].J Exp Med，2013，210(1)：191-203.

[7]Massa O，Alessio M，Russo L，etal.SerologicalProteome Analysis(SERPA)as a tool for the identification of new candidate autoantigens in type 1 diabetes[J].Journal of Proteomics，2013，82(4)：263-273.

[8]Soggiu A，Piras C，Bonizzi L，et al.A discovery-phase urine proteomics investigation in type 1 diabetes[J].Acta Diabetologica，2012，49(6)：4563-464.

[9]周琦，刘一辉.糖尿病研究及其防治[J].现代医药卫生，2013，29(4)：560.

[10]Bhonsle HS，Korwar AM，Chougale AD，etal.Proteomic study reveals downregulation of apolipoprotein A1in plasma of poorly controlled diabetes：a pilot study[J].Mol Med Report，2013，7(2)：495-498.

[11]姜洪娟.2型糖尿病肾病尿液蛋白组学研究及早期诊断标志物的筛选[D].山东大学，2009.

[12]Zurbig P，Jerums G，Hovind P，etal.Urinary proteomics for early diagnosis in diabetic nephropathy[J].Diabetes，2012，61(12)：3304-3313.

[13]Wu J，Chen YD，Yu JK，etal.Analysisofurinary proteomic patterns fortype 2 diabetic nephropathy by ProteinChip[J].Diabetes Research and Clinical Practice，2011，91(2)：213-219.

[14]Zhang D，Yang H，Kong X，etal.Proteomicsanalysisreveals diabetic kidney as a ketogenic organ in type 2 diabetes[J].Am J Physio Endocrinol，2011，300(2)：287-295.

[15]CaiQ，LiB，Yu F，etal.Investigation oftheProtective Effects of Phlorizin on Diabetetic Cardiomyopathy in db/db Mice by Quantitative Proteomics[J].J Diabetes Res，2013：263845.

[16]Ares-Carrasco S，Picatoste B，Camafeita E，etal.Proteome changes in the myocardium of experimental chronic diabetes and hypertension：Role of PPARα in the associated hypertrophy[J].Journal of Proteomics，2012，75(6)：1816-1829.

[17]Essop MF，Chan WA，Hattingh S.Proteomic analysis of mitochondrial proteins in a mouse model of type 2 diabetes[J].Cardiovasc J Afr，2011，22(4)：175-178.

[18]Takahashi E，Okumura A，Unoki-Kubota H，et al.Differential proteome analysis of serum proteins associated with the developmentoftype 2 diabetesmellitus in the KK-Ay mouse model using the iTRAQ technique[J].Journal of Proteomics，2013，84(12)：40-51.

[19]丛林.妊娠合并糖尿病临床诊断与治疗[J].安徽医学，2009，30(4)：364-365.

[20]LangerO，Yogev Y，Xenakis EM，etal.Overweightand obese in gestational diabetes：the impact on pregnancy outcome[J].Am J Obstet Gynecol，2005，192(6)：1768-1776.

[21]吴谨，黄艳波，刘彦.妊娠合并糖尿病70例诊治分析[J].陕西医学杂志，2013，42(4)：453-455.

[22]Vidaeff AC，Yeomans ER，RaminS.Gestationaldiabetes：a field of controversy[J].Ohstet Gynecol Survey，2003，58(11)：759-769.

[23]KjosSL.Pstpartum careof the woman with diabetes[J].Clin Obstet Gynecol，2000，43(1)：75-86.

[24]Kim SM，Park JS，Norwitz ER，et al.Identification of proteomic biomarkers in maternal plasma in the early second trimester that predict the subsequent development of gestational diabetes[J].Reproductive Sciences，2012，19(2)：202-209.

[25]Hassanein M，Rahman JS，Chaurand P，etal.Pierre P.Massion 1，Advances in Proteomic strategies toward the early detection of Lung Cancer[J].Proc Am Thorac，2011，8(2)：183-188.

Diabetes is a chronic disease in humans which is the third serious non-infectious disease to human health in a worldwide scope following cancer and cardiovascular disease.Long-term metabolic disorders of diabetes often causes damage to multiple systems leading to chronic progressive change or dysfunction and failure of heart，eyes，kidneys，nerves and blood vessels.Timely and early diagnosis and treatment of diabetes can effectively control blood sugar levels and prevent complications.With the completion of human genome project，the research field of molecular biology has transferred to the proteomics research.Proteomics is a powerful tool for evaluation of protein expression in the world，which has not yet been widely used in the study of diabetes.Through the comparison of protein expression spectra between diabetes and normal tissue，in this paper it finds new study target spot beneficial to diabetes and its complications，and it also summarizes the proteomics research technique about the pathogenesis of diabetes and its complications.

Diabetes；Proteomics；Application

2014-05-20)

1005-619X(2015)02-0126-04

10.13517/j.cnki.ccm.2015.02.006

116023沈阳军区大连疗养院小平岛疗养区