脑出血动物模型研究进展

段晓春 王中 陈罡

·专题笔谈·

脑出血动物模型研究进展

段晓春 王中 陈罡

本综述为了深入研究脑出血的病理生理过程，对目前用来开展科学研究的常用脑出血模型，包括胶原酶注射脑出血模型，自体血注入脑出血模型，微球囊充盈脑出血模型，高血压性脑出血模型进行了总结。在本文中笔者将详细探讨狗、兔子、猪等不同动物模型制作方法、病理生理机制以及在研究中的优点和缺点。

脑出血；动物模型；研究进展

脑出血是一种致残率和致死率极高的疾病，占所有中风病例的15%[1]。为了深入研究疾病的病理生理过程，需要有效的动物模型提供帮助。目前被用来开展科学研究的常用脑出血模型包括四种：胶原酶注射脑出血模型，自体血注入脑出血模型，微球囊充盈脑出血模型，高血压性脑出血模型。脑出血模型已经应用到狗、兔子、猪等不同的动物模型中，并且被广泛的应用于研究脑出血的损伤机制、神经功能的恢复以及相关的治疗策略。在本文中笔者将详细探讨各种动物模型制作方法、病理生理机制以及在研究中的优点和缺点。

一、脑出血模型

1.胶原酶注射脑出血模型：胶原酶是一种金属蛋白酶，可以分解细胞间基质及血管基底膜上的胶原蛋白，主要分布在人体的脑血管周围，存在于巨噬细胞和单核细胞内，病理情况下其可以从细胞中释放出来并被激活。Rosenberg等[2]于1990年建立的胶原酶诱导脑出血模型已被广泛采用。他们在立体定向仪下用微量泵向大鼠尾状核注入含0.01～1.00 UⅦ型细菌胶原酶的生理盐水2 μl，9 min内完成的实验中发现注入0.5 U胶原酶的出血模型脑出血点周围可见明显水肿，且大鼠几乎都可以存活，他们认为0.5 U胶原酶诱导的脑出血模型适合于实验研究。

将胶原酶注入小鼠尾状核后，小鼠即出现脑内血肿和对侧上下肢瘫痪，行走呈“划圈样”向同侧转圈，神经功能缺失症状在12 h最明显，光镜下术侧尾状核可见明显的出血区，其中细胞几乎全部坏死、周围神经元数目明显减少和基质水肿，形态学证实出血的高峰时间与肢体偏瘫症状的发展过程基本一致。注射胶原酶4 h后，血肿周围可见粒细胞浸润，第3天粒细胞水平达到峰值，1～3 d血肿边缘的神经缺失并伴有小胶质细胞和巨噬细胞的积聚和激活，提示粒细胞的浸润、小胶质细胞和巨噬细胞的积聚和激活均可能引起或加重脑出血后继发的脑损害[3]。

胶原酶诱导脑出血模型的制作方法具有简单、快捷、重复性好的优点，与人脑出血的病理、生化及病理生理有许多相似性[3-4]，且出血区面积的大小可以控制的优点，但由于出血主要以弥漫性出血为主，出血过程缓慢，注射数小时后才会出现血肿，不能形成真正意义上的急性血肿，且出血灶中常混有正常脑组织与临床自发性脑出血的发病不同，故该模型较适用于研究血肿及脑水肿在脑出血中的作用机制及评价脑出血后神经功能的恢复状况和药物的治疗效果。另外，胶原酶本身可以引起局部的炎症反应，对于研究脑出血后的炎症反应机制有一定影响。胶原酶对血管的破坏作用[5-6]，使得该模型血肿周围的血液循环情况与临床脑出血有较大差别，不适合用来进行血肿周围组织血液循环障碍的研究。

2.自体血注入脑出血模型：脑内直接注入自体血是最经典的脑出血模型。自20世纪60年代开始，人们采用向脑内特定区域注入自体血的方法制作了狗、猴、兔和猫等大型动物的脑缺血模型。立体定向技术问世以后，人们开始利用立体定向仪将自体血准确注入大鼠尾状核进行系列研究[7]。出血量的多少应根据动物脑体积的大小而定，Nath等[8]采用的鼠脑注血量分别为25 μl、50 μl和100 μl，分别相当于人脑20 ml、40 ml和80 ml的出血量，这是造成临床上不同程度脑出血的出血量。由于自体血注入的造模方法操作简单，特别是应用立体定向仪后，动物的死亡率明显降低，且血肿位置更加精确，除有不可避免的穿刺针道损伤外无其他异体物质和杂质，故该法造成的脑出血模型的病理过程更接近人的自发性脑出血。

自体血尾状核注射脑出血模型是目前较为理想的脑出血模型。自体血注入法存在注血过程中血液逆流现象，影响了血肿大小形成的稳定性，该模型制作的关键在于控制血液沿针道返流，否则靶点处难以形成足够容量及压力的血肿，无法形成足够的占位效应。由于血液离体后很快在1～2 min内凝固，要延长注射时间只能采用抗凝血。但抗凝血内凝血酶受到抑制，引起的水肿较轻，不适合用来进行脑水肿的研究。要在血液凝固前完成注射必须采用快速注血法，快速注血时造成的严重血液返流使血肿很不规则，靶点处的原发血肿很小，大部分血液沿针道返流至胼胝体、脑室及蛛网膜下腔内。2003年belayev等[9]通过二次注血法大大降低了血液逆流的现象，随后有学者设计了三次注血的制作方法，提高成功率。即在大量注血之前，首先注射少量血液，凝固后将针道堵塞。由于尾状核较为致密，注血时局部压力较高，而新鲜凝固的血块强度很低，很难抵抗血肿膨胀的压力，无法从根本上解决血液返流的难题。在制作自体血脑出血模型的过程中，血肿大小和稳定性与注血量和针道反流量密切相关。在注血量相同的情况下，血肿大小和稳定性主要取决于针道反流量。针道反流量与血肿内压力以及针道阻力有关，针道周围阻力越大则反流量越少。有学者通过预置管24 h后二次注血制作自体血脑出血动物模型，其血肿体积和稳定性均明显优于传统的二次注血法[10]。在置管一定时间后，针道周围脑组织通过纤维蛋白渗出充填和细胞增生等创伤修复机制实现了初步修复，使针道缩小甚至闭合，可有效减轻甚至避免血肿内血液沿针道反流。理想的脑出血模型应尽可能接近临床脑出血的病理生理学变化，形成的血肿应具有良好的稳定性、可重复性和可行性。近年来逐渐被微泵控制注射的方法所取代[3]，有效解决了注血过程中注血速度不稳定对脑组织的冲击伤和血肿大小不稳定的弊端。

自体血注入法不仅可以通过控制注血量进行不同程度脑出血的实验性研究，而且注入的血是非肝素化自体血，可观察到血液凝固过程中释放的血管活性物质对脑循环及脑组织的影响，与临床脑出血的过程较接近，适合于脑实质出血的自然过程、病理形态学特点的研究，还可更好地观察血液凝固过程中各种因子对脑组织代谢和血流的影响，为临床治疗提供一定依据。

3.微球囊充盈脑出血模型：1987年Sinar等首次向脑内插入一微球囊，用生理盐水或造影剂充盈球囊，可产生类似于人脑出血时血肿压迫周围脑组织并使颅内压升高的状况。这种脑出血模型制作方法，其优点在于球囊内液体量可人为控制，能产生一致的、可重复的脑损害，避免了自体血注入法出现血液进入蛛网膜下腔或破入脑室以及血肿形态不一的缺陷，较易观察血肿清除后的效应。理论上该模型为研究自发性脑出血产生的占位效应和血肿清除后的病理生理变化、局部脑血流改变、颅内压力变化提供了手段，可用来评价早期清除血肿后神经功能的改变。故有人利用微球囊充气和放气模拟手术清除血肿过程，研究血肿清除术治疗时间窗及对临床疗效的影响[12]。但此模型不同于真正意义上的脑出血，没有血液成份，不能模拟血液本身的成份在脑出血后脑损伤及脑水肿形成与发展中所起的作用机制，观察不到脑出血所引起的细胞毒性反应，与临床实际情况相差太远，因此该类脑出血模型在近年已较少使用。

4.高血压性脑出血模型：高血压性脑出血是最常见一种脑出血类型，为了更加真实研究这种脑出血的病理机制，近年来许多学者努力寻找和制作高血压性脑出血模型。改变遗传基因获得的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)有易卒中型，其亚种易卒中型自发性高血压大鼠(stroke-prone spontaneously hypertensive rats，SHRSP)被认为是目前研究高血压动脉硬化性脑卒中较理想的动物模型。虽然这种自发性脑出血模型与临床最为接近，但SHRSP有严格的遗传局限性，饲养困难，易变种或断种，发生脑出血时的出血量、位置及出血时间难以控制、重复性差、价格昂贵、来源困难等也限制了其在实验性脑出血研究中的推广应用。黄如训等[13]用内径0.30 mm的银夹钳夹大鼠的双侧肾动脉，使双肾动脉缩窄造成肾血管性高血压的易卒中型肾性高血压大鼠(stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP)模型，其血压峰值高，能稳定在200 mmHg以上，可并发与人高血压病类似的脑动脉损害及各种类型的脑出血。该模型易于建立，价格低廉，且有与人脑出血相似的高血压动脉硬化病理生理基础。但与SHRSP相比，其自发性脑出血的发生率较低，出血量及出血区域也同样无法控制。吴小平[14]在双肾双夹法复制RHRSP大鼠模型的基础上，运用胶原酶加肝素脑内注射诱发脑出血建立的高血压脑出血大鼠模型具有造模时间短、卒中类型及出血部位恒定、重复性好等优点。

二、不同动物的脑出血模型

1.大鼠：大鼠脑出血模型是目前研究脑出血实验动物的主要手段，广泛的应用于大多数实验研究中，建立了许多可信度高，重复性高的实验动物模型。1982年Ropper和Zervas[15]最早报道了单次注血大鼠模型，当时采用异体动脉血，没有形成预想的聚集血肿，可能由于异体血影响并破坏了脑血流。该研究中不可避免的遇到注血后血液沿针道逆流导致血肿体积的差异和注血压力与正常动脉压力不符的问题。近年来逐渐采用微泵注血有效的解决这个问题，微泵可以恒定的控制注血速度，模拟动脉血压，并且极大的减少了针道逆流现象。1990年Rosenberg等采用SD大鼠通过胶原酶注射的方法建立了自发性脑出血模型，因为这种模型最为接近人类脑出血的临床表现，并且重复性高，所以这种模型很快被广泛应用到科学研究当中。

2.小鼠：小鼠脑出血模型应用较为广泛，2004年Nakamura等[16]采用单次注血法比较自体动脉血、异体血和生理盐水对于脑血肿形成的影响。他们发现异体血注入模型出现了更为严重脑水肿，考虑异体血注入脑出血模型可能引发严重局部免疫反应，与人类自发性脑出血有很大不同。为了减少针道逆流现象制作更加一致的小鼠脑出血模型，Belayev等[9]采用二次注血模型，首先给予5 μl肝素化的异体心脏血，7 min后形成血肿，再注射5 μl。Ma和Zhang[17]采用三次注血模型，两次注射5 μl静脉血，7 min后血肿形成，随后在1 min注射20 μl，这种模型也具有一致性的特点。Rynkowski等[18]采用两步法取30 μl尾动脉自体血直接注入右侧纹状体形成脑内血肿，这种方法解决了异体血的免疫反应和肝素化血对血肿形成的影响。

3.兔：Koeppen等[19]采用注射泵注入动脉血制作兔脑出血模型取得成功，他们将从兔耳动脉采集的血液通过注射泵注入丘脑形成脑内血肿，研究对神经行为障碍的影响，这种模型注射速度恒定且延迟拔出针尖，减少了血液逆流。兔脑出血实验动物模型与大动物模型比较，费用较小，成功率高，长期死亡率低，可以研究脑出血后长期神经功能，病理生理机制。1999年曾用自体静脉血注入的方法制作兔脑出血模型进行研究，尽管有脑内血肿形成，但其与动脉性出血有一些不同[20]。

4.猴：黑猩猩和猕猴作为灵长类动物与人类的基因组有很大的相似之处，作为临床前动物实验研究工具被认为最有意义。1982年Segal等[21]在猴右侧脑内注射6 ml自体血形成脑内血肿，观察血肿腔注射尿激酶对血肿的治疗作用。此后1988年，Bullock等[22]采用成年长尾黑颧猴研究脑出血后颅内脑血流的变化，第一次采用导管将股动脉血输注到右侧尾状核制作脑出血模型，其注入压力接近正常的动脉血压，减少了人工注血时操作的不稳定性对血肿形成的影响。以猴做为脑出血实验模型的研究存在费用昂贵的问题，并且涉及多个动物法案和管理的限制，因此这种动物模型的研究工作被取消。

5.狗：1963年Whisnant等[23]制作了狗的脑出血模型进行相关研究工作，单次注射0.5～1.5 ml新鲜自体静脉血至基底核或脑白质，产生不同形状和大小的脑内血肿。1999年Qureshi等[24]采用单次缓慢注射7.5 ml自体动脉血至狗基底核制作脑出血模型，容易出现小脑幕切迹疝导致动物死亡率升高。经过实验发现减少注血体积，注射2.8～5.5 ml的自体动脉血，可以成功建立脑出血模型并且大大减少死亡率和并发症。Lee等[25]进一步改进实验方法，采用注射泵注射3～5 ml自体非肝素化动脉血，8 min后可形成大小形状一致的血肿。以往成功的脑出血模型无法模拟血管破裂的过程，周璇等[26]在超声引导下穿刺大脑中动脉主要分支制作犬脑出血模型。该方法利用超声定位的准确性，应用外力使血管破裂以模拟急性出血，并且方法简单、有效、可重复性好，该模型图像特点与人类脑出血有很好的一致性，可用于脑出血的病理生理、影像诊断及治疗研究，同时可使用同样的方法复制不同部位脑出血。狗脑出血模型对于研究脑出血后认知障碍和长期神经功能障碍有一定优越性，对于进一步揭示病理生理机制有较好的参考价值。但是该模型和猴脑出血模型一样因为费用较高和严格的动物管理标准而受到限制。

6.猪：猪制作脑出血模型与其他动物相比有脑体积较大，血肿形成体积大，易于影像学检查等特点，故早期就有学者对猪脑出血模型进行研究，采用注射泵缓慢注射1.7 ml自体动脉血至额部脑白质形成血肿，这种注射方式最大程度减少了血肿破入脑室和血液通过针道逆流导致血肿减少[27]。因为临床常见的自发性脑出血多是由于微小的薄壁动脉破裂出血，这种方法更接近人类脑出血模型。

三、展望

近年来也有一些特殊类型的脑出血动物模型根据实验目的被制备，例如通过外科手术方法撕裂皮层血管导致的皮层出血模型、淀粉样脑血管病变模型、口服抗凝药物治疗相关的脑出血模型等，根据实验目的合理选择科学的实验动物模型，取得接近人类临床的实验结果[28]。临床目前脑出血模型制作方法所造的实验性脑出血动物模型各有优缺点，说明脑出血动物模型的建立还有待完善。理想的自发性脑出血模型应包括：(1)定量的脑内血肿形成；(2)有继发脑损害形成；(3)接近于人类的脑出血血肿病理生理机制；(4)操作简便和费用低廉。动物实验模型的研究是为了更好的临床工作需要，加快转化医学的研究，以期更好地治疗人类脑出血疾病[29]。目前仍缺乏既有类似人高血压、动脉硬化病理生理基础的，又接近人脑出血发病情况且出血量及出血部位均有较好重复性的脑出血动物模型。脑出血恢复期的动物模型则更加缺乏。建立具有自发性的、稳定的、易于成功复制的、便于定量研究的脑出血动物模型仍是今后脑出血模型的研究方向。将自发性脑出血与人工诱导脑出血模型的优点结合并加以改进，将有可能制作出较理想的脑出血动物模型。

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The research progress of animal model of cerebral hemorrhage

Duan Xiaochun,Wang Zhong, Chen Gang.
The Department of Neurosurgery,The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006,China
Corresponding author:Chen Gang,Email：nju_neurosurgery@163.com

For the reason to study the procedure of pathophysiology of cerebral hemorrhage, this review has summarized the models currently used in cerebral hemorrhage scientific research including cerebral hemorrhage model by injection of collagenase,by injection of autologous blood,by filling microsphere and by hypertensive.In this paper,the author will discuss in detail the making method of different animal model such as dog,rabbit,pig,etc.and pathophysiological mechanism and advantages and disadvantages in the research work.

Cerebral hemorrhage;Animal model;Research progress

2015-02-09)

(本文编辑：张丽)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.02.011

215006苏州，苏州大学附属第一医院神经外科

陈罡，Email：nju_neurosurgery@163.com

段晓春,王中,陈罡.脑出血动物模型研究进展[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(2)：100-103.