微小核糖核酸在缺血性卒中研究中的进展

李海龙，毕晓莹

微小核糖核酸（micro ribonucleic acids，miRNAs）作为一种小分子（约22个核苷酸）非编码核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），主要在转录后调节相应基因的表达，尽管这种调节机制还未被完全阐明，但目前初步认为它主要通过与目标信使RNA（messager RNA，mRNA）3’端未翻译的区域完全互补或部分互补地紧密配对结合，进而使目标mRNA退化或者抑制其下一步的翻译[1]。有研究通过闭塞大鼠右侧大脑中动脉模拟短暂脑缺血，发现脑组织和血液均有特异性miRNAs的高表达[2]。另有研究发现，在同样的模型中，短暂闭塞大脑中动脉及永久闭塞大脑中动脉的大鼠血浆中miR-124浓度在干预后8 h开始升高，24 h达高峰，与假手术组相比升高近150倍，意味着组织损伤特异性的miRNAs可被用来作为缺血性卒中的敏感生物学标记物[3]。而利用miRNAs这种调节基因表达的特性，通过某种传递系统减少引起病理损害和异常基因表达的miRNAs，提高发挥有益功能的miRNAs水平，可用于包括缺血性卒中等缺血性疾病的治疗[4]。本文对缺血性卒中的病因、诊断、治疗、预后等方面中近些年来有关miRNAs的研究进展做一综述，为miRNAs接下来在临床上的实践应用研究提供依据。

1 miRNAs在缺血性卒中高危因素中的作用

缺血性卒中的发生与多种致病因素有关，最常见的原因是头部或颈部的动脉血管进行性狭窄，这种血管狭窄常由动脉粥样硬化造成[5]。高脂肪饮食所导致的低密度脂蛋白、胆固醇、甘油三酯水平升高是动脉粥样硬化具有显著意义的危险因素。当脑动脉血管过于狭窄，血细胞便可聚集并形成动脉粥样硬化斑块。这些斑块可以在其形成的部位直接阻断动脉血管或者脱落后在下游较小的脑动脉处阻塞血管。

组织特异性是miRNAs表达的一个重要特征[6]。有研究对大鼠颈内动脉进行miRNAs微阵列芯片分析，在180个miRNAs阵列中，正常的大鼠颈内动脉中发现了140个，其中有49个miRNAs高度表达[7]。血管内切应力损伤血管内皮细胞进而引起脂质沉积是动脉粥样硬化形成的重要机制。众多研究已证实，血管内切应力决定动脉粥样硬化易发生于血管分叉及弯曲处[8]。有研究报道，血管内切应力可诱发内皮细胞产生miR-21，在内皮细胞中，高表达的miR-21可抑制凋亡基因磷酸酶基因，增强苏氨酸激酶及一氧化氮合成酶的磷酸化，增加一氧化氮（nitric oxide，NO）的产生，从而防止内皮细胞的凋亡[9]。miRNAs还参与阻止白细胞的黏附聚集，血管细胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）是由被炎症因子激活的血管内皮细胞表达的细胞间黏附分子，可通过与白细胞基本表达的α4β1-整合素蛋白相结合黏附于血管内皮细胞，研究发现，miR-126表达的减少可引起VCAM-1的表达增高，且静息状态的血管内皮细胞正常表达miR-126[10]，提示miR-126的表达可抑制VCAM-1，进而阻止白细胞黏附于血管内皮细胞，并可能具有抗炎作用。

高脂血症已被证实是脑血流低灌注和缺血性卒中的重要危险因素。最近的有关miRNAs在调节胆固醇平衡方面的研究显示，在人类和大鼠的细胞中，miR-33可抑制三磷酸腺苷结合盒转运子（adenosinetriphosphate-binding cassette transporter，ABCA1）的表达从而减缓胆固醇流向载脂蛋白，因此，在巨噬细胞中，miR-33的高表达和拮抗作用可明显改变胆固醇的流向，这在过量的胆固醇逆途径运输回肝脏的过程中起关键作用[11]。在粥样斑块的脂质核心形成过程中，miRNAs调节粥样斑块相关的巨噬细胞摄取低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）从而转化为泡沫细胞。研究发现，在被氧化型LDL刺激后的巨噬细胞中，miR-125a-5p可介导其对脂质的摄取并减少一些炎症因子的分泌释放（诸如白细胞介素-2、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β）[12]，因此，miR-125a-5p的上述作用可能在防止动脉粥样硬化进展中发挥重要保护作用。

高血压病是缺血性卒中的一项显著危险因素，miRNAs直接参与血管紧张素Ⅱ型1受体基因多态性增强血管紧张素1受体活性的机制并与血压升高相关联[13]。有关研究发现，当对人类的主要血管平滑肌细胞使用抑制转录的miR-155抑制剂进行转染，内源性的人血管紧张素Ⅱ型1受体的表达和血管紧张素Ⅱ介导的细胞外调节激酶（extracellular regulated proteinkinases，ERK）活性均显著升高[14]。相关的动物实验研究显示，成年高血压大鼠与正常大鼠相比，主动脉中的miR-155表达减少，且与血压的水平呈负相关，同时还发现，主动脉中miR-208的表达程度与血压和年龄均呈负相关[15]，这表明miR-155很可能参与了高血压病的发展及其病理过程。

2 miRNAs作为缺血性卒中诊断性生物学标记物的研究

目前，卒中的诊断和分型主要依赖于临床医师的物理检查并辅以多种影像学检查技术作为补充，与急性冠状动脉综合征中可检测肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶作为诊断性生物学标记物不同，由于缺乏快速性、精确性和敏感性的生物学标记物的检测机制，暂无应用于临床的卒中相关血浆生物学标记物。来源于各种组织和器官的血浆miRNAs具有很好的稳定性并且可耐受核酸酶的消化和其他恶劣环境，比如煮沸、过高或过低的PH值、长期的存放以及冰冻-融化循环[16]。威斯康星大学的Dharap等[17]对大鼠短暂大脑中动脉阻断恢复再灌注后在不同的时间点测定miRNAs以了解其功能作用，在恢复灌注后3 h到3 d的5个时间点中，与假手术组相比，所估测的238种miRNAs中有8种表达增多，12种表达减少，且发生变化的miRNAs与多种介导炎症、神经保护、受体功能和离子平衡的mRNA相关，而加利福尼亚大学的Da-Zhi Liu等[18]对缺血性卒中、脑出血和红海藻盐癫痫的大鼠模型造模24 h后测定脑组织和全血中的miRNAs显示，至少在一种实验模型中，有5种miRNAs在脑组织和全血中同时上调，4种miRNAs同时下调，更为显著的发现是miR-298是所有模型造模后唯一在脑组织和血液中均有上调的miRNAs，这与之前的研究中发现短暂大脑中动脉阻断后脑组织和血液中miR-298同时上调的结果一致[2]。这表明血浆miRNAs可能成为用来诊断卒中的一种具有较高敏感性和特异性的血浆生物学标记物。

有研究得出结论，在年轻卒中患者中，miRNAs的表达明显受卒中的影响，其表达在卒中病变动脉的大小、卒中类型以及不同的预后结局均不同[19]。一项意在寻找脑梗死中脑组织特异性的miRNAs作为可能生物学标记物的研究发现，在大脑和小脑中分别检测到了389和395种miRNAs，其中有13种miRNAs的表达具有脑组织特异性，对该miRNAs阵列中信号最强的三种miRNAs进一步分析后显示，miR-124几乎在仅在脑组织中表达，在大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occasion，MCAO）大鼠模型中，血浆miR-124浓度在造模后6 h明显升高，并且在48 h仍有升高，而作为对照的假手术大鼠中miR-124浓度一直在初测值的下限，线性回归分析显示大鼠脑梗死面积与血浆miR-124浓度无关联，因此，miR-124有可是脑梗死的一种生物学标记物[20]。另一项以miR-210作为急性缺血性卒中生物学标记物的研究显示，与正常健康对照人群相比，急性缺血性卒中患者血液中的miR-210明显减少，特别是在卒中发生后的7 d和14 d，而且，在卒中患者中，预后较好人群的miRNA-210水平高于预后较差的人群。在该研究随后的动物学实验中，miR-210在血液和脑组织中的水平呈正相关。以上研究提示，血液miR-210可能是急性缺血卒中诊断和预后判断的一种全新的敏感性生物学标记物[21]。此外，血液循环中miR-145也被发现在缺血性卒中的患者中较对照人群有显著的升高，同样也值得作为生物学标记物去更深入地研究[22]。如能发现一种或多种血浆生物学标记物，通过在紧急状态下检测这种标记物便可对卒中进行诊断、分型甚至预测再发，这将具有极其重要的价值。

3 miRNAs在缺血性卒中治疗中的研究进展

缺血预适应（ischemic pre-conditioning，IPC）是以不足以引起大脑缺血损伤所介导的细胞途径，这种途径可减少随后缺血性损伤对脑组织的损害[23]。缺血性卒中发生时有miRNAs表达的变化，一些miRNAs可能具有一定神经保护作用，而对IPC的分析研究可直接揭示miRNAs在神经保护中的作用，进而为寻找缺血性卒中患者新的治疗方法提供可能。在一项以IPC与缺血性卒中发生后miRNAs变化作对照的研究中发现，miR-200和miR-182两大miRNAs家族在脑缺血预适应后3 h选择性地上调，体外试验显示，将8种在体实验中选择性上调的miRNAs转染进小鼠脑神经瘤细胞中后，该细胞的生存能力较对照组增强，提示这些miRNAs具有神经保护作用，其中具有最大神经保护效应的miR-200b、miR-200c和miR-429通过下调脯氨酰羟化酶-2（prolyl hydroxylase 2）水平发挥作用[24]。另一项关于小鼠短暂缺血预适应模型中miRNAs变化及作用靶点的研究显示，缺血预适应组的miRNAs表达与假手术组、缺血性卒中组及耐受组有差异，预适应所调节的miRNAs主要作用于甲基CpG结合蛋白2（methyl-CpGbinding protein 2，MeCP2）mRNA，而缺血预适应通过减少miR-132表达的同时增加甲基CpG结合蛋白2蛋白，但却对MeCP2 mRNA水平无影响，敲除MeCP2的小鼠对缺血极为敏感，提示miRNA和MeCP2可成为缺血预适应介导的缺血耐受的效应物[25]。此外，国内首都医科大学的一项研究对miRNAs在缺氧预适应（hypoxic pre-conditioning，HPC）及MCAO小鼠造模后6 h的表达进行分析后发现，有19种miRNAs通过一系列重要的调节途径（柠檬酸循环、糖酵解途径、氧化磷酸化途径等）对蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）βII、PKCγ和新型PKCε相互作用蛋白进行调节，而这几种PKC亚型已被证实参与HPC介导的神经保护作用，其中下调miR-615-3p水平可通过调节一种被称作14-3-3γ的蛋白在HPC介导的神经保护中发挥重要作用[26]。这些研究有助于更好地理解缺血缺氧预适应所介导的耐受机制，寻找新的临床治疗靶点，为缺血性卒中的治疗及预防提供新的策略。

有关miRNAs在缺血性卒中潜在治疗效应的一系列研究发现，在动物实验及体外实验中，通过上调或抑制一些miRNAs的表达进而调节mRNA翻译表达相应的蛋白质，可起到神经保护及抑制神经细胞凋亡的作用。有研究发现，在体外试验中，暴露于缺血缺氧环境后，神经元细胞和星形胶质细胞miRNAs的表达种类及随时间变化各不相同，因此，miRNAs的这种在脑组织缺血后时间性和空间性的表达模式值得更进一步的研究，并有助于促使新的治疗干预措施被发现[27]。新加坡国立大学的Sepramaniam等[28]对MCAO大鼠模型中断1 h供血模拟缺血性卒中，随即给予侧脑室注射miR-320a抑制剂及miR-320a前体，并对水分子通道蛋白-1（aquaporin 1，AQP-1）和AQP-4的表达以及脑组织梗死区大小进行测定，研究结果发现，miR-320a可直接作用于AQP-1和AQP-4的mRNA并可影响缺血条件下AQP-1和AQP-4表达，其中miR-320a前体起抑制作用，而miR-320a抑制剂表现为激活作用，且可明显减少缺血性卒中后的梗死区面积，提示miR-320a可作为缺血性卒中的潜在治疗靶点。其另一项有关miRNAs调节水通道蛋白的研究发现，miR-130a、miR-152、miR-668、miR-939和miR-1280在缺血性卒中星形胶质细胞中高度表达且可调节AQP-4M1亚型启动子活性，而miR-130a被认为是AQP-4M1亚型的翻译表达抑制剂，在体实验的结果显示，miR-130a抑制剂可上调AQP-4M1亚型mRNA转录活性及其蛋白产物，并缩小脑梗死区面积促进梗死的恢复[29]。有关miRNAs神经保护作用的研究还发现，在体实验和体外实验中，miR-223可调节羟甲基恶唑丙酸受体亚型GluR2和天门冬氨酸受体（N Methyl D aspartate receptor，NMDAR）亚型NR2B的表达，进而参与调节NMDA介导的海马神经元中的钙离子内流和兴奋性毒性作用，miR-223不足可引起高水平表达的GluR2和NR2B，促进NMDA介导的钙离子内流，增加海马神经元的微小兴奋性突触后电位的产生[30]，这表明miR-233的这种神经保护特点可能成为缺血性卒中的新的治疗方法。与miR-233的这种保护作用不同的是，miR-181参与加重缺血性卒中的脑损伤，在小鼠MCAO模型再灌注早期，mi-181水平升高的损伤区域常注定会坏死，而mi-181减少的区域有被挽救的可能，该研究证实，miR-181可能通过抑制一种具有细胞保护作用的分子伴侣——葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）的表达加重神经损伤，减少或阻止miR-181的表达可能具有保护脑功能的作用[31]。

这一系列体内及体外实验的研究结果均提示，miRNA在调节缺血性卒中发生后神经细胞死亡的一些途径中具有关键作用，通过控制miRNA的表达水平来对缺血性损伤进行干预可能成为未来卒中治疗的一项新的治疗方法。

4 总结与展望

目前，通过成熟的动物模型和分子生物学检测技术，很多miRNAs在缺血性卒中中的作用和功能已被有效地认识和识别[32]，同时miRNAs还参与了缺血性卒中的众多危险因素的发生与形成，循环血中miRNAs较好的理化稳定性使其有理由成为一种可靠的非侵入性的临床生物学标志物，其通过抑制mRNA的翻译来调节多种重要蛋白表达的特点为缺血及再灌注的脑损伤治疗提供了新的方法对策。现阶段，大多数有关miRNAs和卒中的相关研究还主要集中在动物卒中模型和体外试验中，有关miRNAs的诊断和治疗作用的临床实验研究期望在不久的将来得到有效地开展。

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