基质金属蛋白酶-2在血管新生过程中的研究进展

赵光贤 朴丽梅（综述） 成宪武（审校）

基质金属蛋白酶-2在血管新生过程中的研究进展

赵光贤 朴丽梅（综述） 成宪武（审校）

基质金属蛋白酶-2；血管新生；基质蛋白；内皮祖细胞

基质金属蛋白酶（MMP）是 Zn2+、Ca2+依赖的无活性酶原形式存在的肽链内切酶，是一类有降解细胞外基质（ECM）能力的蛋白水解酶家族，在肿瘤细胞的浸润及远处转移和血管新生过程中起到关键作用[1,2]。人类中已识别和定性的MMPs至少有26种，分为5大类。明胶酶A，即基质金属蛋白酶-2（MMP-2）为Ⅳ型胶原酶，是蛋白水解酶家族中最常见成员之一。MMP-2以无活性酶原的形式由多种细胞（成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和恶性肿瘤细胞等）分泌[3]，在激活剂的作用下转变为成熟的酶。MMP-2可以降解细胞外基质，使细胞间质的空隙变大，为肿瘤血管的形成提供有利的空间；还参与协调内皮细胞间的相互作用和局部迁移，增强内皮细胞移动的能力，通过提高血管内皮增殖因子（VEGF）间接地参与血管形成，以及作为促进血管形成的因子直接参与新生血管的形成。本文对MMP-2在缺血性和非缺血性血管新生过程中的相关作用综述如下。

1MMP-2的生物学特征

MMP-2是相对分子质量为72 KD的中性蛋白酶。MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子组成，结构基因总长度为27 kb[4]。与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5′旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。MMP-2蛋白中主要含有3个重要的片段，即氨基末端片段、金属结合片段及羧基末端片段。氨基末端带有高度保守序列PRCGV/NPD，具有 1个半胱氨酸残基，该残基与激活位点的锌原子作用调节MMP-2前体的激活；金属结合片段是目前公认的锌离子结合部位，其旁侧含有2个组氨酸的保守序列HE-GH；羧基末端具有类似凝血酶结构的片段，但目前该片段的具体功能尚未明确[5]。

活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，主要在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。

2 MMP-2在血管新生过程中的若干机制

2.1 MMP-2在缺血后血管新生过程中的干预 近年来研究指出，MMP参与了炎症、缺血、创伤后治愈及肿瘤等病态下的血管新生过程[5-8]。人们对肿瘤血管形成过程中MMP的表达及其调节机制有了较深的了解，但对缺血性血管再生过程中的MMP动态变化、细胞的分布及如何调节等目前尚不十分清楚。因此，Cheng等[9]利用单侧下肢缺血模型，通过定量聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction，PCR）和酶谱法分析MMP动态变化。其结果显示，在野生型小鼠缺血组织中，术后第4天MMP-2 mRNA表达量及其活性明显增加，1周达到最高峰并持续维持了21天。免疫组织化学染色结果显示，MMP-2主要分布在毛细血管内皮细胞中。酶谱法分析小鼠大动脉环培养液中蛋白酶活性，结果表明，主要是MMP-2的明胶分解活性。在血管内皮生长因子（VEGF）刺激下，培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的MMP-2 mRNA表达量明显高于其他两种MMPs（MMP-9和MT1-MMP）。以上研究结果提示，MMP-2在缺血性血管新生中可能起着重要作用。

内皮细胞的游走、浸润及增殖等一系列细胞活动在血管新生过程中非常重要[10]。研究表明，明胶酶A（MMP-2）与细胞膜的ανβ3整合素结合存在于细胞膜，参与肿瘤细胞移动和浸润[5]。为进一步证明MMP-2是否调控内皮细胞的功能，用byoden chambers法比较了基因敲除小鼠和野生型小鼠大动脉来源皮细胞的游走能力和浸润能力。结果表明，MMP-2缺损小鼠动脉内皮细胞的血管内皮细胞增殖因子浸润能力明显下降，但是游走能力和增值能力无明显差异。由此可见，MMP-2主要通过血管内皮细胞浸润为介导来干预血管新生的过程。

在体内试验中，Cheng等[9]使用MMP-2基因敲除的小鼠和野生型小鼠做一侧下肢缺血模型，通过血管造影、激光多普勒、缺血组织切片观察毛细血管密度等参数，并进行比较研究，发现MMP-2基因缺损小鼠侧支血运情况及血管新生明显下降。而且在骨髓细胞分析中发现，该基因缺损显著影响骨髓来源的内皮祖细胞的动员、归巢等功能，并且将MMP-2++的野生型小鼠骨髓移植到MMP-2基因缺损的小鼠上后，其缺血肢体血流及血管新生明显改善。此研究证明骨髓内皮祖细胞参与了动脉粥样斑块及其营养血管的形成过程[11]，从而首次明确了MMP-2通过调控骨髓内皮祖细胞的动员、归巢及其功能而促进血管生成。另外值得一提的是，MMP-2不是唯一调控骨髓内皮祖细胞动员、归巢及其功能的蛋白酶，其他的细胞蛋白酶如组织蛋白酶也参与其中，并起重要作用[12]。有待更多的基础及临床研究来进一步澄清各种细胞外蛋白酶在骨髓内皮祖细胞动员及归巢中的相互作用及其机制。

2.2 MMP-2在血管缺血后及老化中的血管新生机制 老年人的血管再生功能减退、组织修复能力低下。近年，国内外研究发现，在缺血性血管再生过程中，低氧诱导因子-1α（HIF-1α）发挥了重要的作用。HIF-1α是缺氧状态下血管生成的核心调控因子，通过促进多种血管生成因子的分泌，从表达水平、作用时间、作用范围上协同调控，立体调整缺氧后的血管生成。一些研究提出，衰老很可能与HIF-1α稳定性及老年缺血性血管再生功能减退有着密切联系。2010年，Cheng等[13]发现，在缺血骨骼肌组织与老年老鼠细胞中的HIF-1α稳定性和表达明显受损。运动不仅诱发PI3K/AKt依赖的HIF-1α激活，同时减弱脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylases）/HIF-1α抑制因子（FIH）介导的HIF-1α的退化。随着HIF-1α的激活增加，在缺血组织中VEGF、Fit-1及MMP-2等血管生成因子和骨髓造血细胞的表达也随之增高，进而促使EPCs增加并促进其功能。这种机制最终导致CD34+/c-Kit+等似EPC细胞的释放并参与血管生成，促进缺血后的血管新生及血流的回复。这种IGF-1介导、PI3K/AKt依赖的HIF-1α激活增加的机制可阐明运动在老化引起的心血管疾病中的保护机制。由于基因敲除或药物性MMP-2阻滞剂在一系列试验中的应用起到了抵消运动诱发的血管生成的作用，所以可以认为缺氧诱导的MMP-2被PI3K/HIF-1α/VEGF信号途径重新激活，可能是运动引起的血管保护机制。

3 促进MMP-2在血管新生过程作用的增强剂

NF-κB是近年发现的细胞内最重要的核转录因子，它在许多细胞刺激介导的细胞信息的转录调控中起核心作用，参与多种基因的表达和调控，是细胞激活的标志。NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在于静息细胞中，与DNA模块上的特异蛋白结合，诱导特异mRNA的产生，而NF-κB信号通路的激活可调控miR-29的水平下降[14]。

微小RNA（miR）是一类存在于多种生物体中可调控基因表达的内源性非编码小分子RNA[15]。Jones等[16]研究25例胸主动脉瘤患者的miR-29的表达情况，发现只有miR-29a表达下调，miR-29b和miR-29c表达均无变化。另一项研究表明，血管内皮细胞在生成血管过程中miR-29a确实起到了调节作用[17]。

Cai等[18]通过对CNV的研究表明，miR-29a表达的抑制反而刺激了内皮细胞上MMP-2的水平增加，并发现在脉络膜-RPE（视网膜色素上皮组织）中NF-κB的激活降低了miR-29的含量，进而上调了MMP-2蛋白的水平，且形成一个NF-κB-miR-29-MMP-2环型电路，从而起到了促进血管新生的作用。

4 MMP-2抑制血管新生

近年来以MMP为靶向目标，抑制其酶活性的阻滞剂（MMPI）及其合成产物的相关研究逐步趋向成熟[19]。根据血管生成抑制剂作用靶点不同，将其分为以下8种：①直接作用于受体酪氨酸激酶（PTK）抑制剂；②直接作用于核酸（RNA）的抑制剂；③直接作用于VEGF的抑制剂；④作用于基质金属蛋白酶抑制剂；⑤直接作用于新生血管内皮细胞的抑制剂；⑥作用于整合素蛋白的拮抗剂；⑦非特异性血管生成抑制剂；⑧天然药物及其成分中具有潜在抑制血管生成的物质。

受制于内源性组织抑制剂TIMP家族包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4 等[20]。其中TIMP-2为MMP-2的天然特异性组织抑制剂。有研究显示，MMP-2一旦与细胞表面的受体分离，其活性可迅速被TIMP-2抑制。TIMP-2与活性状态的MMP-2以1∶1分子比例非共价结合，这种结合是不可逆且稳定的。其作用机制可能通过TIMP-2中17-19位点的亮氨酸-缬氨酸-异亮氨酸与MMP-2的 S1′S2′S3′区域结合，使 MMP-2 第 16 位上的天冬氨酸残基的羧基和其活性中心的Zn2+结合，从而抑制其活性。MMP-2还能与MMP-2酶原结合而起抑制作用。

近年来也有一些关于外源性MMP-2抑制剂的研究报道。有研究表明，姜黄素通过下调MMP-2可以抑制人类乳腺癌细胞[21]、黑色素瘤B16F10细胞[22]的侵袭作用。刘立民等[23]研究还发现，姜黄素通过抑制MMP-2活性及增强TIMP-2活性进而降低前列腺癌PC-3M细胞的侵袭能力。Yang等[24]研究发现，白藜芦醇在人类肺腺癌细胞中还可以通过抑制JNK和P53磷酸化，减少NF-κB介导的蛋白表达和核内活化蛋白-1的水平，导致MMP-2表达下调，抑制肿瘤细胞的侵袭。

ST104P （a tetrameric cyclic compound of 4，5 dihydroxynaphthalene-2，7-disulfonic acid linked by methylene bridges）是一个合成的聚酯硫酸化铬酸盐大环状复合物，内含4个单位萘。Ma等[25]通过明胶酶谱分析表明，ST104P以剂量相关依赖，并强有力地抑制内皮细胞上MMP-2的活性；同时通过ELISA法和免疫印迹法分析表明，ST104P减弱了MMP-2的投放以显露，最终减少了MMP-2在血管内皮细胞中的蛋白水平。因此，ST104P是一个通过对MMP-2的下调节而起到有效抑制血管内皮细胞分泌MMP-2的作用，进而减弱了血管内皮细胞的迁移及血管新生。然而这些说法仍有不足之处，目前不清楚还有哪些附加的通路参加并调节了抑制血管新生过程，仍待进一步的研究。也有部分有关MMP-2抑制剂应用于临床的试验研究已完成，并得出了与上略有不同的结果[26]。

目前虽然发现部分药物可以通过下调MMP-2而在一些疾病的发生发展过程中发挥作用，但仅限于实验研究或临床试验过程，有待于更多MMP-2抑制剂的临床应用研究，去指导治疗病态血管新生疾病研究。

［1］Gialeli C，Theocharis AD，Karamanos NK.Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting.FEBS，2011，278：16-27.

［2］王煜.基质金属蛋白酶及其在慢性阻塞性肺疾病中的应用.疑难病杂志，2011，10：394-398.

［3］刘江，何建方，施柏年，等.慢性肝病患者血清基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-2组织抑制因子与肝纤维化指标的关系.临床内科杂志，2005，22：522-524.

［4］刘友良，黄平.基质金属蛋白酶-2与肿瘤关系的研究进展.现代肿瘤学，2006，14：109-111.

［5］Bauvois B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers：Outside-in signaling and relationship to tumor progression.Biochimicaet Biophysica Acta，2012，1825：29-36.

［6］Kessenbrock K，Plaks V，Werb Z.Matrix Metalloproteinases：Regulators of the Tumor Microenvironment.Cell，2010，141：52-67.

［7］Tan RJ，Liu Y.Matrix metalloproteinases in kidney homeostasis and diseases.Am J Physiol Renal Physiol，2012，302：F1351-1361.

［8］Szarvas T，vom Dorp F，Ergün S，et al.Matrix metalloproteinases and their clinical relevance in urinary bladder cancer.Nat Rev Urol，2011，8：241-254.

［9］Cheng XW，Kuzuya M，Nakamura K，et al.Mechanisms underlying the impairment of ischemia-induced neovascullarization in matrix metalloproteinase 2-deficient mice.Circ Res，2007，100：904-913.

［10］Lamalice L，Le Boeuf F，Huot J.Endothelial cell migration during angiogenesis.Circ Res，2007，100：782-794.

［11］Cheng XW，Huang Z，Kuzuya M，et al.Cysteine protease cathepsins in atherosclerosis-based vascular disease and its complications.Hypertension，2011，58：978-986.

［12］Jiang H，Cheng XW，Hu L，et al.Cathepsin K-mediated Notch1 activation contributes to neovascularization in response to hypoxia.Nat Commun，2014，5：3838.

［13］Cheng XW，Kuzuya M，Kim W，et al.Exercise Training Stimulates Ischemia-Induced Neovascularization via phophatidylinositol3-Kinase/Akt-Dependet Hypoxia-Induced Factor-1 Reactiva－tion in Mice of Advanced Age.Circulation，2010，122：707-716.

［14］Chen KC，Wang YS，Hu CY，et al.OxLDL up-regulates microRNA-29b,leading to epigenetic modifications of MMP-2/MMP-9 genes：a novel mechanism for cardiovascular diseases.FASEB J，2011，25：1718-1728.

［15］Tang G，Tang X，Mendu V，et al.The art of microRNA：various strategies leading to gene silencing via an ancient pathway.Biochim Biophys Acta，2008，1779：655-662.

［16］Jones JA，Stroud RE，O′Quinn EC，et al.Selective microRNA suppression in human thoracic aneurysms：relation ship of miR-29a to aortic size and proteolytic induction.Circ Cardiovasc Genet，2014，4：605-613.

［17］ Yang Z，Wu L，Zhu X，et al.MiR-29a modulates the angiogenic propertiesofhuman endothelialcells.Biochem Biophys Res Commun，2013，434：143-149.

［18］Cai JJ，Yin GB，Lin B，et al.Roles of NFκB-miR-29s-MMP-2 circuitry in experimentalchoroidalneovascularization.J Neuroinflammation，2014，15：88.

［19］Li X，Wu JF.Recent developments in patent anti-cancer agents targeting the matrix metalloproteinases （MMPs）.Recent Pat.Anticancer Drug Discov，2010，5：109-141.

［20］Cheng XW，Kuziya M，Nakamura K，et al.Menchanisms of the inhibitory effect of epigallocatechin-3-gallate on cultured human vascular smooth muscle ceel invasion.Arterioscler Thomb Vasc Biol，2005，25：1864-1870.

［21］Sharm RA，Geseher AJ，Stewerd WP.Cureumim：the story or far.Eur J Cancer,2005，419：1955-1968.

［22］Banerji A，Chakrabarti J，Mitra A，et al.Effect of curcumin on gelatinase A （MMP-2） activity in B16F10 melanoma cells.Cancer Lett，2004，211：235.

［23］刘立民，常喜华，王伟华，等.姜黄素对前列腺癌PC-M细胞抗侵袭作用的研究.中华实验诊断学，2006，10：1085-1087.

［24］ Yang YT， Weng CJ， Ho CT， etal.Resveratrolan along3，5，4trim-ethoxy transstilbene inhibits invasion of human lung adenocarinoma cells by suppressing the MAKP pathway and decreasing matrix-metalloproteinase 2 expression.Mol Nurfood Res，2009，53：407-416.

［25］Ma YL，Lin SW，Fang HC，et al.A novel poly-naphthol compound ST104P suppresses angiogenesis by attenuating matrix metalloproteinase-2 expression in endothelial cells.Int J Mol Sci，2014，15：16611-16627.

［26］Shi ZG，Li JP，Shi LL，et al.An updated patent therapeutic agents targeting MMPs.Recent Pat.Anticancer Drug Discov，2012，7：74-101.

Role of the matrix metalloproteinase system in neovascularization

Matrix metalloproteinases-2；Angiogenesis；Extracellular matrix protein；Endothelial progenitor cell

2010-2013/2012-2015年度国家自然科学基金（项目编号：30960128/81260068）

133000 吉林省延边市，延边大学附属医院心血管内科

赵光贤，E-mail：zhaoguangxian94@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．03．002

R54

A

1672-5301（2015）03-0198－04

2015-01-06）