基质金属蛋白酶类在颅脑损伤中的作用机制

黄志纯 田新华

基质金属蛋白酶类在颅脑损伤中的作用机制

黄志纯 田新华

继发性脑损伤是影响颅脑损伤发展和预后的重要因素之一，早期病情的诊断和进展预测将有助于诊断并进行适当的治疗，减轻或避免某些继发性损伤以提高患者的疗效，改善 预 后 。 近 年 来 ，随 着 对 基 质 金 属 蛋 白 酶 系 (matrix metalloproteinases，MMPs)的不断深入研究，金属蛋白酶系在继发性脑损伤中的作用日益受到人们的重视。本文就基质MMPs在颅脑外伤方面的研究概述如下。

一、MMPs家族

(一)MMPs家族概述

MMPs家族是一组含锌的中性蛋白酶基因家族，属于金属蛋白酶超家族中的亚型，主要由血管平滑肌细胞、内皮细胞及单核细胞等产生。在脑组织中，胶质细胞、小胶质细胞、毛细血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等多种细胞可产生MMPs。MMPs有着共同的分子结构，从N端至C端依次为信号肽、前肽、催化区，在研究蝌蚪形态变化时发现，至今其成员已达 20 多种[1-2]。依据其底物特异性、蛋白质结构及序 列同源性分为 4 个 亚型：(1)胶 原酶类：MMP-1、MMP-8、MMP-13；(2)明胶酶类：MMP-2、MMP-9，又称明胶酶 A、B；(3)基 质 降 解 酶 类 ：MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7 和MMP-26；(4)膜型金属蛋白酶类：MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24 和 MMP-25。MMPs的主要功能是降解细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，其中降解血管基底膜的主要成分为：明胶、IV型和V型胶原、黏连蛋白、弹性蛋白及纤连蛋白。一种MMP可以直接降解某一种或几种ECM，也可以通过激活其他类型的MMPs而发挥作用，从而形成瀑布效应。在生理条件下，MMPs参与胚胎发育、组织重塑、创伤愈合和血管发生；在病理条件下，其参与纤维变性、关节炎等的病理改变及肿瘤的生长、迁移、侵袭、和转移等[3-5]。研究还发现，MMPs尤其是 MMP-9、MMP-2 还参与创伤性中枢神经损伤的病理过程。脑毛细血管壁基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原、层黏蛋白和纤黏蛋白。脑损伤后直接的机械暴力导致局灶性出血，最终引起血管内皮细胞、平滑肌细胞及胶质细胞分泌MMPs，使基底膜通透性和结构改变，从而导致微血管出血加重病情。

(二)MMP-2、MMP-9 的生理特性

MMP-2、MMP-9 通常在中性 pH 值条件下发挥活性，需要内源性 Zn2+、Ca2+参与时活性最大。两者均以无活性的前体形式分泌，经蛋白酶水解或在有机汞如4-醋酸氨基苯汞作用下而激活，其活性可被螯合剂或基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitorofmetalloproteinase，TIMP)所抑制，不受其他蛋白酶类如丝氨酸蛋白酶类抑制剂的影响。MMP-2活化后分子 质 量 为66 000或62 000。 其ECM底物包括明胶、Ⅳ 、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、弹性蛋白、层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖。MMP-9 主 要以前酶原(78 000～82 000)的形 式合成，其ECM底物包括明胶、Ⅳ、Ⅴ型胶原、弹性蛋白。目前在中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)内有关 MMPs的研究中，免疫组化研究显示正常人CNS、血管周围细胞和小胶质细胞有低水平的 MMP-9 的表达，MMP-2 阳性细胞少见。体外培养的大鼠小胶质细胞激活后可分泌MMP-9，人海马锥体细胞亦可合成MMP-9。有研究报道发育中的小鼠胚脑有 MMP-9mRNA的表达，提示MMP-9与神经发育有关，而MMP-2 与神经轴突的再生有关[6]。很多细胞因子和生长因子调节 MMP-2和 MMP-9的基因转录和活性，MMPs的生物活性由转录、酶原活化和蛋白水解酶等调节。具有诱导活化的因素包括白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)等；具有抑制作用的因素有干扰素β-1b。TGF-β可增加人成纤维细胞培养基MMP-2 的水平。IL-1α和 TNF-α可促进人血管平滑肌细胞(smoothmuscle cell，SMC)分泌 MMP-9，但对 MMP-2mRNA无影响。MMPs的蛋白水解酶活性受非特异性和特异性抑制剂的抑制，非特异性抑制剂包括a2巨球蛋白、a1抗蛋白酶和 BB-94；特异性抑制剂为 TIMP。目前已发现的 TIMP 有 4种[7]：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4。TIMP 以 1∶l的比例与活化的 MMPs结合，并抑制其活性。TIMP-1 抑制大多数 MMPs活性；TIMP-2 除对 MMP-9 以外，对大多数 MMPs均有抑制作用；TIMP-3 具有抑制 MMP-1、2、3、9、13 活性的作用。TIMP-1和TIMP-2是多功能蛋白，结构—功能研究已将 TIMP-1 对 MMP 的抑制作用与其促进作用分开。TIMP-3是唯一存在于ECM内的TIMP家族成员，初步了解它可能是一种细胞最终分化的标志物。TIMP-4 有参与稳定 ECM 的功能，目前对其仍知之甚少。

二、MMPs在颅脑损伤中的作用

近年来MMPs与颅脑损伤的相关性逐渐为国内外学者所重视，尤其是 MMP-9 和 MMP-2[8]与缺血性脑损伤关系密切。颅脑损伤后继发的缺血、缺氧性损害是造成预后不良的重要因素。重型颅脑损伤后早期脑缺血的发生率极高，且缺血程度与预后明显相关[9]。MMPs对神经系统的作用和影响十分广泛，国内外许多研究证实，脑缺血时MMPs表达升高，降解 ECM 导致血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏，引发血管源性脑水肿，出血转化乃至神经元损伤[10-12]。多项动物实验和临床研究中发现，脑缺血及再灌注损伤可诱导MMPs的表达，尤其是 MMP-9 和 MMP-2 活性增加[8]。Asahi等[12]发现MMP-9基因剔除导致大鼠脑缺血后，BBB破坏和白质成分的降解都少于对照组，脑损伤体积也相应减小。在脑损伤病理过程中，MMPs与脑血管通透性增高、BBB破坏、炎性细胞 侵 入 和 脑 水 肿 等 明 显 相 关[13-15]。 其 中 起 主 导 作 用 的 是MMP-9和MMP-2，早期主要涉及 MMP-2，它是由膜型MMP激活的，短时间内恢复正常；迟发的BBB开放和破坏可持续几天，造成严重的脑组织损害、出血、水肿、脑梗死等，MMP-9在脑组织和血中显著升高而起了主导作用。

(一)MMPs对 BBB 的影响

BBB主要由脑毛细血管内皮细胞、内皮细胞间紧密连接、血管基底膜以及胶质细胞终足构成。基膜是包绕脑毛细血管内皮细胞的一种特殊形式的ECM，主要由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等构成，这三者均是MMPs的作用底物。脑毛细血管细胞间的紧密连接是由跨膜蛋白和胞浆辅助蛋白(如 ZO-1、ZO-2、ZO-3、AF-6和 cingulin等)等构成的复杂连接体，通过胞浆辅助蛋白(主要为 ZO)与细胞骨架相连接，在内皮细胞间形成连续的封闭网[16]。ZO-1 是 MMP-9的作用底物，可被MMP-9降解。神经创伤时MMP-9活性升高，水解血管基质成分——Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和纤维连接蛋白，以及紧密连接蛋白ZO-1，使基膜和紧密连接结构破坏，BBB通透性增加，导致血管源性脑水肿。抑制MMPs活性，可使通透性下降，减低脑水肿[15-17]。

颅脑损伤后缺血、血流动力学改变、炎症及氧化应激都可以刺激炎性细胞、神经元、内皮细胞和胶质细胞，从而激活MMPs系统。神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和侵入的中性粒细胞都可以表达大量MMPs。颅脑损伤所造成的BBB开放和破坏机制，是由多种因素参与的一系列瀑布样反应过程，最终由MMPs等蛋白酶直 接 参 与 BBB 的 开 放 和 破 坏[10]。 涉 及 到 的 MMPs 包 括MMP-2、MMP-9、MMP-3以及MT-MMP等，起主导作用的是MMP-2、MMP-9，过度表达的MMP-9可破坏BBB，造成血管源性脑水肿，同时炎性细胞侵入缺血受损的脑组织，从而加重脑损害。

(二)MMPs诱导神经细胞凋亡

正常细胞黏附于ECM，激活多种信号传导通路，保证了细胞的存活、生长和增殖。当细胞与ECM脱离黏附接触或者是接触不完全时会出现凋亡，这种凋亡被称为失巢凋亡。MMPs 尤 其 是 MMP-9 的 过 度 表 达 可 导 致 神 经 元 凋 亡[18]。Gu 等[18-19]采 用 神 经 元 标 志 物 微 管 相 关 蛋 白 -2 (microtubule-associated protein-2，MAP-2)的 抗 体 和 TUNEL双重标记方法进行检测发现，在体外培养皮质神经元中加入活化的 MMP-9 可诱导细胞凋亡，而加入 MMP-9 抑制剂后神经元凋亡被阻断。该实验显示，TBI后MMP-9表达的出现时间及高峰到达时间均与细胞凋亡的相应时间一致，两者都与继发性颅脑损伤有关，提示MMP-9可能参与TBI后继发性神经细胞凋亡过程。

(三)MMPs参与颅脑损伤后的炎症反应

越来越多的证据表明，炎症反应时多种细胞因子可上调MMPs表达。然而，MMPs又不仅仅被动地作为炎症反应的下游产物而出现，它还对许多促炎因子发挥正反馈作用，是炎症反应的“调节剂”。颅脑损伤作为一种细胞外应激信号，激活了多个信号转导系统，如氧化应激和丝裂原活化蛋白激酶通路。这2条信号转导通路涉及的主要蛋白质是活化蛋白 -1(AP-1)和 核 转 录 因 子 -kB(NF-kB)。 已 有 研 究 证 实 ，MMP-9 的基因启动子在 NF-kB、AP-1、SP-1 有结合位点，促炎因子可以通过这些位点上调MMP-9的表达，作为一种炎症 介 质 参 与 炎 症 反 应 。MMP-9 可 以 将 分 子 质 量 26 000 的TNF-α 前 体 裂 解 成 为 具 有 活 性 形 式 的 分 子 质 量 17 000 的TNF-α[9]。 TNF-α 则 可 以 通 过 TNF-α 的 受 体 TNFR 诱 导MMP-9的释放。神经创伤后的炎症反应在创伤后迅速发生，这种无菌性的炎症反应，将产生大量的炎症细胞因子，包括 TNF、IL-1、IL-6 等，这些炎性细胞因子和 MMP-9 之间存在着正反馈的关系，从而加剧了脑损伤后的炎症反应。

MMPs激活发生在脑损伤早期，推动了脑外伤后炎症的发生发展。MMPs破坏血管基底膜，而基底膜的降解使中性粒细胞能够向损伤脑组织聚集、浸润，由此引发一系列炎性反应。此外，白细胞介素-6、TNF-α等多种细胞因子又可使MMPs 的 表 达 显 著 增 高 ，加 重 组 织 损 伤 ，形 成 恶 性 循 环[13]。因此，在脑损伤、脑缺血后的炎性反应中，MMPs的作用不容忽视。

(四)MMPs参与白质脱髓鞘和轴突变性崩解

髓鞘碱性蛋 白(myelin basic protein，MBP)是构成髓鞘的主要蛋白质，在CNS内由少突胶质细胞合成和分泌。MBP是 MMP-9 的作用底物，MMP-9 特异性地降解 MBP，对其他髓鞘蛋 白如 PLP 和 DM 20 无 降解作用[14]。 脑创伤后 MMP-9的活性升高，可降解MBP，以致髓鞘脱失，白质损伤，脑功能损害。

三、展望

综上所述，MMPs在颅脑损伤的继发性损害的发生、发展过程中起重要作用，它参与了BBB的破坏，导致血管源性脑水肿、炎性反应、微循环障碍、神经细胞凋亡、白质脱髓鞘和轴突变性崩解等。深入研究MMPs参与脑损伤后脑继发性损害的作用机制，可为颅脑损伤的治疗提供新靶标。

[1]Visse R,Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:structure,function,and biochem istry[J].Circ Res,2003,92(8):827-839.

[2]Guo M,Cox B,Mahale S,et al.Pre-ischemic exerei reduces matrix metalloproteinase-9 expression and ameliorates bloodbrain barrier dysfunetion in stroke[J].Neuroscience,2008,151 (2):340-351.

[3]Lauer D,Slavic S,Sommerfeld M,et al.Angiotensin type 2 receptor stimulation ameliorates left ventricular fibrosis and dysfunction via regulation of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1/Matrix metalloproteinase-9 axis and transform ing grow th factor β1 in the rat heart[J].Hypertension,2014,63(3):e60-e67.

[4]Malemud CJ.Matrix metalloproteinases(MMPs)in healthand disease:an overview[J].FrontBiosci,2006,11(1):1696-1701.

[5]Singh A,Maurya OP,Jagannadhan MV,et al.Matrix metalloproteinases(MMP-2 and MMP-9)activity in corneal ulcer and ocular surface disorders determ ined by gelatin zymography[J].JOcul BiolDis Infor,2012,5(2):31-35.

[6]Pfefferkom T,Rosenberg GA.Closure of the blood-brain barrier by matrix metalloproteinase inhibition reduces rtPA-mediated mortality in cerebral ischem ia w ith delayed reperfusion[J].Stroke,2003,34(8):2025-2030.

[7]Lukaszew icz-Zajac M,M roczko B,Kornhuber J,et al.Matrix metalloproteinases(MMPs)and their tissue inhibitors(TIMPs) in the tumors of central nervous system(CNS)[J].J Neural Transm,2013,121(5):469-477.

[8]Rosenberg GA.Matrixmetalloproteinase in neuroinflammation [J].Glia,2002,39(3):279-291.

[9]Fater M,Stroick M,Griebe M,etal.Matrixmetalloproteinases in cerebrovascular diseases[J].Cerebrovasc Dis,2005,20(3): 141-151.

[10]Lee P,Kim J.W illiams R.Effects of aging on blood brain barrier and matrix metalloproteases follow ing controlled cortical impactinmice[J].Exp Neurol,2012,234(1):50-61.

[11]Suofu Y,Clark JF,Broderick JP,etal.Matrixmetalloproteinase-2 or-9 deletions protect against hemorrhagic transformation during early stage of cerebral ischem ia and reperfusion[J]. Neuroscience,2012,212(6):180-189.

[12]Asahi M,Wang X,Mori T,et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of bloodbrainbarrier and white matter components after cerebralischem ia[J].JNeurosci,2001,21(19):7724-7732．

[13]Vajtr D,Benada O.Correlation of ultrastructural changes of endothelial cells and astrocytes occurring during blood brain barrier damage after traumatic brain injury w ith biochemical markers of BBB leakage and inflammatory response[J].Physiol Res,2009,58(2):263-268.

[14]Gursoy-Ozdem ir Y,Qiu J,Matsuoka N,et al.Cortical spreading depression activates and up-regulates MMP-9[J].J Clin Invest,2004,113(10):1447-1455．

[15]Kim GW,Gasche Y,Grzeschik S,et al.Neurodegeneration in striatum induced by the m itochondrial toxin3-nitropropionic acid:role of matrix metalloproteinase-9 in early blood-brain barrier disruption[J].JNeurosci,2003,23(25):8733-8742．

[16]Mori T,Wang X,Aoki T,et al.Down regulation of matrix metalloproteinase-9 and attenuation of edema via inhibition of ERK m itogen activated protein kinase in traumatic brain injury [J].JNerotrauma,2002,19(11):1411-1419.

[17]Oppenheim HA,Lucero J,GuyotAC,etal.Exposure to vehicle emissions results in altered blood brain barrier permeability and expression of matrix metalloproteinases and tight junction proteins inmice[J].PartFibre Toxicol,2013,10(12):62.

[18]Gu Z,Kaul M,Yan B,et al.S-nitorsylation of matrix metalloproteinases signsling pathway to neuronal cell death[J]. Science,2002,297(5584):1186-1190.

[19]Lee JY,Lee HE,Kang SR,et al.Fluoxetine inhibits transient global ischem ia-induced hippocampal neuronal death and memory impairment by preventing blood-brain barrier disruption[J].Neuropharmacology,2014,79(1):161-171.

2015-01-02)

(本文编辑：张丽)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.01.011

福建省科技厅重点项目(2010D025)

361004 厦门，厦门大学附属中山医院神经外科

田新华，Email：tianxinhua@126.com

黄志纯,田新华 .基质金属蛋白酶类在颅脑损伤中的作用机制[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(1):39-41.