神经干细胞与创伤性颅脑损伤后的神经修复

高亮 章小清

·专题笔谈·

神经干细胞与创伤性颅脑损伤后的神经修复

高亮 章小清

外伤性脑损伤是当今社会致死、致残的主要原因。神经干细胞(NSCs)的治疗研究就是试图通过引入新的细胞来替代丧失的神经元，或者所引进细胞通过神经营养作用来增加受损的神经细胞的存活、可塑性和功能的恢复来发挥作用。本文从干细胞在神经修复治疗中的背景、机制、策略及展望几个方面进行了综述。

外伤性脑损伤；神经干细胞；干细胞移植

外伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)仍然是当今社会致死、致残的主要原因。虽然救治成功率已经有明显提高，但TBI仍然給大量患者造成了严重的神经功能障碍，带来了严重的社会问题和沉重的经济负担。TBI后可导致大量的神经元丧失。急性期神经细胞死亡始动于机械性的损伤，并由此启动了造成神经细胞坏死和凋亡的微环境，可以导致的持续的细胞凋亡、胶质化、脱髓鞘等，这不仅发生在损伤局部而且可以弥散到其他脑区。弥漫性损伤主要发生在海马区，严重TBI患者中超过80%存在海马区神经元的大量丧失，造成TBI后严重的神经功能及记忆、认知功能障碍[1]。神经干细胞(neural stem cell，NSCs)的治疗研究试图通过引入新的细胞来替代丧失的神经元，或者所引进细胞通过神经营养作用来增加受损的神经细胞的存活、可塑性和功能的恢复来发挥作用，这是TBI后神经修复治疗的核心内容[2-3]。迄今为止，各种类型的干细胞，包括胚胎干细胞，NSCs和间充质干细胞目前正在被用于移植研究来治疗中枢神经系统损伤。越来越多的证据表明，基于干细胞移植的治疗方法可能是用于治疗TBI后功能障碍的最有前途的治疗策略。文章对干细胞移植治疗TBI的背景、策略及可能存在的问题作一基本的探讨。

一、干细胞治疗创伤性颅脑损伤的背景

干细胞是一种具有无限自我复制能力和向多种细胞分化潜能的细胞。按其来源分为胚胎干细胞和成体干细胞，按分化潜能干细胞可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞。多能干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，如骨髓间充质干细胞、NSCs、造血干细胞、脂肪干细胞等。

既往认为，中枢神经系统的神经细胞在出生前或出生后不久就失去再生的能力，且成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡就不能再生。随着研究的深入，这一传统概念已被颠覆。目前已公认，成年哺乳动物(包括人类)中枢神经系统中存在内源性NSCs，主要分布于侧脑室壁的室管膜下区(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranular zone，SGZ)，脊髓室管膜区和白质也普遍存在NSCs。NSCs具有自我更新、活跃的增殖能力、具备向特定部位迁移以及分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。神经系统损伤后，内源性NSCs或者外源性的干细胞可在多种因素作用下增殖，向病灶处迁移，填补和部分修复损伤的神经组织，同时NSCs分泌多种神经营养因子，促进受损细胞的修复，因此NSCs对于颅脑创伤后神经组织及功能的修复具有重要的治疗意义[4]。目前被广泛用于神经系统疾病治疗研究的干细胞有骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、NSCs和胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)等。

二、干细胞在神经修复治疗中的机制

人们普遍认为，成年人在损伤后刺激中枢神经系统再生将可能需要一个或多个以下的进程：细胞更换、提供神经营养因子、促进轴突导向和去除抑制轴突生长的因素、细胞内信号传导的调控、桥接和材料、和/或调节的免疫反应。干细胞是通过何种机制促进神经功能恢复，至今为止尚不明确，根据现有的模型动物研究推测[5]，可能与以下机制有关：(1) NSCs能分化成神经元、星形胶质细胞并形成突触，与宿主现有的神经细胞形成突触连接从而替代受损的神经细胞整合到神经环路中发挥作用；(2)分泌细胞因子：NSCs能分泌一些神经营养因子，如神经细胞营养因子、表皮生长因子，成纤维细胞生长因子等，调节内、外源性NSCs的增殖、分化、促进神经的再生和重构；(3)促进血管的生成：干细胞移植后体内血管内皮生长因子、促血管生成素等因子的量有所升高，这些因子能促进新生血管的生成，因此推测NSCs能通过促进新生血管的生成，为受损的脑组织提供充足的血液及营养物质，促进神经功能的恢复。(4)诱导抗炎反应，稳定局部微环境：新近的研究表明，移植的干细胞能通过调整机体的抗炎因子与促炎因子重新达到平衡，稳定局部微环境，减少神经细胞的损伤，促进神经功能的恢复[6,7]。

三、干细胞应用于颅脑损伤后神经修复的策略

NSCs的应用主要集中以下方面：(1)诱导和调控内源性干细胞的增殖和分化；(2)直接移植外源性干细胞进行替代治疗，以及应用各种手段调控内源性或外源性干细胞的增殖、迁移、分化等；(3)干细胞作为基因载体，携带起治疗作用的基因进行移植，从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用。这些方法在TBI的动物模型上已经展现出治疗效果。

(一)内源性NSCs的动员

哺乳动物大脑的SVZ和SGZ区域终生都有神经组织生成的过程。成人大脑中有自NSCs产生的新生神经元。NSCs具有自我更新和多向分化能力，可以分化为胶质细胞和神经元细胞。海马齿状核中持续存在颗粒层神经元死亡，SGZ的NSCs/前体细胞可以增殖以保持齿状核中神经细胞数目的恒定。而且，齿状核中新生的神经元可以伸出轴突至海马的CA3区域[8]。TBI可以诱导海马细胞的增殖，绝大多数的SGZ区域的存活超过10周的新生细胞最终分化成神经元。新生的神经元在TBI后2周就可以向CA3区域发出轴突，最终可以观察到实验大鼠认知功能的改善；在正常的成年大鼠，SVZ来源的神经母细胞可以沿着吻侧迁移流迁移到嗅球，最终在此分化成中间神经元以最终取代死亡的神经细胞，成年脑内的内源性成年脑内的内源性NSCs处于静止状态，在神经系统损伤或者某些因素刺激后，内源性NSCs被激活，大量增殖并在某些趋化因子作用下迁移至病损部位[9]；皮层损伤时，SVZ来源的神经母细胞还可以改变迁徙方向，迁徙到损伤部位分化成神经元和胶质细胞[10]。这个增强的神经生成反应提示了通过在现存的神经网络中提供多能干细胞以促进功能恢复的可能。但内源性干细胞数量上相对较少，且有些干细胞离受损部位距离远,到达不了受损区域。这种修复作用有限，尤其是在严重的脑损伤情况下，神经替代程度不足。通过将未分化的干细胞或者通过各种途径获得的干细胞样的细胞可以产生各种有利或者不利的影响，因为这种移植细胞在损伤的微环境下，会产生各种生长因子、细胞因子和趋化因子，可能对损伤的进展和修复的过程产生深远的影响。尽管在受损和病理状态下，NSCs反应性增殖、分化和迁移，但只有很少一部分新生神经元存活并进入神经环路，大部分新生细胞死亡，其他的则分化成为星形胶质细胞和少突胶质细胞。如何发现更多直接有效的干预手段以调控内源性NSC的增殖、迁移和定向分化，是将来研究的重点内容。

(二)外源性NSCs的植入

以往脑内移植或神经组织移植研究进展缓慢，主要受到胚胎脑组织的来源、数量以及社会法律和伦理等方面的限制。而且还存在着异体免疫排斥反应。人们发现干细胞能通过自身非神经组织(包括皮肤、骨髓、脂肪组织等)获得，进而分化成为NSCs，使用体外培养的干细胞可以克服这些问题。常用于外源性细胞移植的主要有(1)NSCs：NSCs能通过不对称分裂产生除自身以外的其他细胞，植入宿主体内的NSCs能够向受损和病变的部位趋行、聚集并且能够存活下来，增殖分化成为神经元和胶质细胞，建立联系，部分恢复宿主缺失的功能。NSCs的存在、分离以及NSCs系的建立，可以提供无限的神经元和胶质细胞，解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的问题；(2)骨髓间充质干细胞：骨髓间充质干细胞是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞，由于细胞具有分化成间叶组织细胞的能力而得名。间充质干细胞在适宜微环境下可分化为神经元细胞。它具有很强的自我更新能力和可塑性。具有取材方便、制备容易、抗原性弱、突变性弱、安全性和稳定性良好等特点，是临床试验中应用最广的移植细胞；(3)胚胎干细胞：胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团中的一种二倍体细胞，具有长期未分化增殖的能力。胚胎干细胞具有多向分化能力，主要通过修复受损神经元轴突，形成完整的神经环路发挥作用。目前基因转染胚胎干细胞移植是研究的热点。文献中还有应用脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞进行干细胞移植研究的报道。

NSCs的分化能力可受不同移植部位的微环境。常见的移植途径包括[11]：(1)脑局部移植，通过立体定位仪经穿刺针注射干细胞。可使移植的细胞能集中在受损组织中或其周围，便于直接、迅速、高效地发挥作用，缺点在于对大脑造成二次损伤，且脑内注射存在容积占位效应，移植的细胞量相对较少，移植的风险较大，而且损伤区的炎性微环境不利于细胞的生存、增殖及分化，急性期移植的NSCs的成活率较低；(2)经侧脑室移植：移植的干细胞能通过室管膜下区，进入脑实质并沿胼胝体向外迁移，到达受损的海马、大脑皮质和纹状体等部位；侧脑室是一个腔隙，里面充有脑脊液，侧脑室移植时的容积占位效应较脑实质内移植弱，因此可增加植入细胞的量，提高移植的成功率；(3)经血管途径(静脉或者动脉途径)：通过血管移植的途径，NSCs进入血液循环系统。脑组织受损，在炎性反应过程中释放的化学因子使血脑屏障的通透性增大。移植的NSCs在趋化因子的作用下，随着血液循环，透过血脑屏障进入脑组织到达受损部位，发挥作用；(4)腰椎穿刺植入该方法主要应用于脊髓损伤模型动物实验研究，将干细胞注入到蛛网膜下腔，干细胞经脑脊液循环流遍整个大脑和脊髓，在蛛网膜下腔贴附、增殖和分化，适用于病变范围广泛的神经功能疾病的治疗；(5)其他：如通过鼻内途径植入颅内的方法作为一种新兴的移植手段越来越受到关注[12]。

目前许多研究发现，外源性NSCs和内源性NSCs之间存在相互作用的一方面，内源性NSCs是移植的NSCs脑部内环境的一部分，这对移植NSCs的生物学行为起到非常重要的作用，因此内源性NSCs有助于提高移植NSCs的疗效。另一方面，许多研究发现，干细胞(包括NSCs)移植进入病理状态或年老的大脑，能够刺激内源性NSCs，引起神经再生，起到保护作用[13]。移植的干细胞通过自身产生和诱导宿主脑内的血管细胞及神经细胞分泌的细胞因子和营养因子，不但能减轻病理性损害造成的神经细胞损伤，而且能促进神经、血管发生和轴突发芽及白质重建。外源性的NSCs对损伤脑组织的修复，最大的可能是通过其分泌的神经营养因子促进内源性NSCs的分化、增殖、迁移，增强内源性干细胞的修复作用。Mollinari等[14]认为不论是内源性还是外源性NSCs，均可能是通过其分泌的神经因子改善损伤区域的微环境，来完成对受损脑组织的修复。

(三)干细胞向神经元定向分化的调控

神经再生修复过程的机制复杂，尚未完全明确，自然状态下，NSCs的神经再生作用往往不能完全发挥，或往不理想方向发展(如形成胶质瘢痕)，因此，需借助各种干预措施，诱导、调控NSC的迁移、分化以修复损伤。干细胞向神经元定向分化受多种信号通路的调控，同时，多种内源性及外源性的化学物质或生长因子/细胞因子以及细胞共培养模式、导入外源基因、多种中枢神经系统药物应用等方法等均可以促进干细胞向神经细胞的增殖及分化等生物学行为，这也是NSCs改善颅脑损伤后神经修复治疗研究中的热点内容。干细胞向神经元分化过程中涉及多条信号通路，包括Notch、Wnt、音猬因子(Hedgehog homolog sonic，HHS)、核因子-kB (NF-kB)等。Zhang等[15]通过研究发现生存素，作为Wnt/β catenin蛋白信号通路的主要成分，能够促进创伤性脑外伤后神经细胞的再生，提示可以通过上调生存素的表达或能有效治疗脑外伤；Shi等[16]通过使用小分子LM1A-31调控神经营养因子受体P75，显著增加外伤性脑损伤后海马区NSCs的增殖与生存，并指出这可能成为外伤性脑损伤的潜在治疗策略；Hatori等[17]发现维甲酸和成纤维生长因子能促进猕猴胚胎干细胞向神经元分化；对创伤性脑外伤的修复有促进作用，Sun等[18]通过实验证实，脑室内注射碱性成纤维细胞生长因子有助于创伤性脑外伤大鼠模型海马区内源性NSCs的增殖。胰岛素生长因子(insulin-like growth factors，IGF-1)，的高表达也可以促进脑外伤大鼠模型海马区内源性NSCs的增殖及树突形成[19]。还有研究通过口服给予辛伐他汀，也可以通过促进内源性NSCs的增殖和分化，改善模型大鼠的神经功能状态[20]。中枢神经系统药物对干细胞定向分化的作用：如法舒地尔、神经节苷酯、依达拉奉、氟西汀、以及中药如人参皂苷、银杏提取物等均可能通过诱导干细胞向神经元样细胞分化[21]。物理治疗手段，如亚低温[22]、高压氧[23]治疗等以及丰富环境[24]、康复训练均可能通过对NSCs的调控作用有助于神经修复的过程,提示通过联合药物、理化措施等通过调控NSCs的生物学行为，提高TBI神经修复治疗效果的可能。

四、问题和展望

虽然现在对NSCs的基础和治疗研究有大进步。在干细胞移植治疗TBI的研究中，相关的神经生物学及动物模型已经展现了相当诱人的前景，在临床上也有少量治疗TBI和脊髓损伤的研究报道[25-26]。但目前干细胞移植研究仍基本处在基础或动物实验阶段，离临床研究或人体试验阶段还有很长的一段路走。即使在基础研究阶段，仍有很多问题亟待解决。如NSCs神经元方向分化的影响因素和机制、干细胞如何在体内生长和分化，干细胞如何能在TBI复杂的微环境中如何能够很好的长期生存并增殖、定向分化并与宿主细胞整合在一起形成功能性的神经环路、干细胞移植的时机、途径以及干细胞移植后的长期生物学效应以及安全性等。因此，仍需深入的研究以了解干细胞的动员模式和机理，寻找恰当的动员措施和干预手段，借助适当的生物材料和技术[26]，探索最佳的输送时机，通过合适的输送途径，严格调控其神经再生作用，以及将一系列动物实验转化为临床试验和循证医学证据，这是目前神经再生领域研究的难点和重点。相信随着各项研究工作的深入，应用NSCs修复中枢神经系统创伤有望在不久的将来成修复极具潜力的治疗手段。

[1]Richardson RM,Singh A,Sun D,et al.Stem cell biology in traumatic brain injury:effects of injury and strategies for repair [J].J Neurosurg,2010,112(5):1125-1138.

[2]Xiong Y,Mahmood A,Chopp M.Neurorestorative treatments for traumatic brain injury[J].Discov Med,2010,10(54): 434-442.

[3]Zhang ZG,Chopp M.Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic[J].Lancet Neurol,2009,8(5):491-500.

[4]杨璇,臧大维.内源性NSCs的应用及其基础研究[J].生理科学进展,2014,45(6):471-474.

[5]Chopp M,Li Y,Zhang ZG.Mechanisms underlying improved recovery of neurological function after stroke in the rodent after treatment with neurorestorative cell-based therapies[J].Stroke, 2009,40(3Suppl):S143-145.

[6]Zhang R,Liu Y,Yan K,et al.Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanisms of mesenchymal stem cell transplantation in experimental traumatic brain injury[J].J Neuroinflammation,2013,10(1):106.

[7]Dixon KJ,Theus MH,Nelersa CM,et al.Endogenous NeuralStem/Progenitor Cells Stabilize the Cortical Microenvironment after Traumatic Brain Injury[J].J Neurotrauma,2015,Feb 27. (Epub ahead of print).

[8]Emery DL,Fulp CT,Saatman KE,et al.Newly born granule cells in the dentate gyrus rapidly extend axons into the hippocampal CA3 region following experimental brain injury [J].J Neurotrauma,2005,22(9):978-988.

[9]Chen XH,Iwata A,Nonaka M,et al.Neurogenesis and glial proliferation persist for at least oneyear in the subventricular zone following brain trauma in rats[J].J Neurotrauma,2003,20 (7):623-631.

[10]Kernie SG,Erwin TM,Parada LF.Brain remodeling due to neuronal and astrocytic proliferation after controlled cortical injury in mice[J].J Neurosci Res,2001,66(3):317-326.

[11]杨坦,刘华,王肇光,等.应用于缺血缺氧性脑病治疗的NSCs移植:现实与未来[J].中国组织工程研究,2014,18(1): 143-148.

[12]阎雪晶,王欣玲,杨咪咪,等.经鼻内途径移植骨髓间充质干细胞治疗脑损伤:还有多少问题待验证[J]?中国组织工程研究,2014,(37):6046-6050.[13]Cova L Armentero MT, Zennaro E,Calzarossa C,Bossolasco P,Busca G,Lambertenghi Deliliers G,Polli E,Nappi G,Silani V,Blandini F.Multiple neurogenic and neurorescue effects of human mesenchymal stem cell after transplantation in an experimental model of Parkinson's disease[J].Brain Res,2010,1311(1):12-27.

[14]Mollinari C,Ricci-Vitiani L,Pieri M,et al.Downregulation of thymosin beta4 in neural progenitor grafts promotes spinal cord regeneration[J].J cell sci,2009,122(22):4195-4207.

[15]Zhang L,Yan R,Zhang Q,et al.Survivin,a key component of the Wnt/β-catenin signaling pathway,contributes to traumatic braininjury-induced adult neurogenesis in the mouse dentate gyrus[J].Int J Mol Med,2013,32(4):867-875.

[16]Shi J,Longo FM,Massa SM.A small molecule p75(NTR) ligand protects neurogenesis after traumatic brain injury[J]. Stem Cells,2013,31(11):2561-2574.

[17]Hatori M,Shimozawa N,Yasmin L,et al.Role of retinoic acid and fibroblast growth factor 2 in neural differentiation from cynomolgus monkey(Macaca fascicularis)embryonic stem cells[J].Comp Med,2014,64(2):140-147.

[18]Sun D,Bullock MR,McGinn MJ,et al.Basic fibroblast growth factor-enhanced neurogenesis contributes to cognitive recovery in rats following traumatic brain injury[J].Exp Neurol,2009, 216(1):56-65.

[19]Carlson SW,Madathil SK,Sama DM,et al.Conditional overexpression of insulin-like growth factor-1 enhances hippocampal neurogenesis and restores immature neuron dendritic processes after traumatic brain injury[J].J Neuropathol Exp Neurol,2014,3(8):734-746.

[20]Xie C,Cong D,Wang X,et al.The effect of simvastatin treatment on proliferation and differentiation of neural stem cells after traumatic braininjury[J].Brain Res,2015,30(3):1-8.

[21]杜云霞,王晓虹,王苏平.中枢神经系统药物促进干细胞定向分化为神经元的研究进展[J].转化医学杂志,2014,3(3): 174-179.

[22]Bregy A1,Nixon R,Lotocki G,et al.Posttraumatic hypothermia increases doublecortin expressing neurons in the dentate gyrus after traumatic brain injury in the rat[J].Exp Neurol,2012,233(2):821-828.

[23]Zhang XY,Yang YJ,Xu PR,et al.The role of β-catenin signaling pathway on proliferation of rats neural stem cells after hyperbaric oxygen therapy in vitro[J].Cell Mol Neurobiol,2011,31(1):101-109.

[24]Nudi ET,Jacqmain J,Dubbs K,et al.Combining Enriched Environment,Progesterone,and Embryonic Neural Stem Cell Therapy Improves Recovery after Brain Injury[J].J Neurotrauma,2015,18(3):Epub ahead of print.

[25]Zhang ZX,Guan LX,Zhang K,et al.A combined procedure to deliver autologous mesenchymal stromal cells to patients with traumatic brain injury[J].Cytotherapy,2008,10(2):134-139.

[26]Yoon SH,Shim YS,Park YH,et al.Complete spinal cord injury using autologous bone marrow cell transplantation and bone marrow stimulation with granulocyte macrophage-colony stimulating factor:Phasse I/II clinical trial[J].Stem Cells,2007, 25(8):2066-2073.

[27]Santos T,Maia J,Agasse F,et al.Nanomedicine boosts neurogenesis:new strategies for brain repair[J].Integr Biol (Camb),2012,4(9):973-981.

Neural stem cells and nerve repair after craniocerebral injury

Gao Liang,Zhang Xiaoqing.
Department of Neurosurgery,Tenth People's Hospital of Tongji University,Shanghai 200000,China

Gao Liang,Email:lianggaoh@126.com

Craniocerebral injury is the leading cause of lethal and disability in nowadays. Treatment of neural stem cells(NSCs)is trying to introduce new cells to replace dead neurons,or increase the survival,plasticity and functional recovery of the damaged nerve cells by neurotrophic effects on the introduced nerve cells.This article has reviewed from aspects as background, machanisms,strategies and prospects on stem cells nerve repair therapy.

Traumatic brain injury;Neural stem cell;Stem cell transplantation

2014-12-13)

(本文编辑：张丽)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.03.011

国家基础研究计划资助(2012CB966300)；国家重大科学研究计划资助(2012CB966300)

200000上海，同济大学附属第十人民医院神经外科

高亮，Email：lianggaoh@126.com

高亮,章小清.神经干细胞与创伤性颅脑损伤后的神经修复[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2015,1(3):169-172.