基质辅助激光解析电离质谱和电喷雾质谱共同快速确证达托霉素结构

黄亚娟+张拓+韩治国+孟晓光+宋纯艳+刘曙晨+郑俊杰+魏开华

摘 要 运用基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF MS）和电喷雾-四级杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS）快速确证环脂肽达托霉素的结构。首先，ESI检测达托霉素相对分子量为1619.7107，与理论值偏差0.0007。选择其双电荷峰m/z 809.848作为母离子进行ESI串联质谱（MS/MS）测定，成功匹配了达托霉素环外氨基酸序列C9H19CO-Trp-Asn-Asp。其次，优化LiOH裂解达托霉素的实验条件，以MALDI-TOF/TOF MS监测开环效果，获得95%以上的开环样本后， 分别运用MALDI和ESI进行MS/MS测定，达托霉素开环产物的b+和y+全部被匹配，达托霉素全部氨基酸序列得到确证。最后，对开环产物的ESI-MS/MS条件进一步优化，获得了丰富的低端碎片离子，解析了脂肪酸链结构，并绘制了脂肪酸链的裂解图。本方法快速、简便、准确，是确证环脂肽类化合物结构的可靠方法。

关键词 达托霉素; 环脂肽; 串联质谱; 电喷雾质谱

1 引 言

达托霉素（Daptomycin）是从玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）发酵液中提取的一种新型环脂肽类抗生素，能迅速杀死绝大部分革兰氏阳性菌，并且在体外对已呈现甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强活性^[1]。达托霉素分子式为C72H101N17O26，含1个亲水核及1个亲脂尾^[2]，它具有新颖的化学结构：4位苏氨酸（Threonine ，Thr）的羟基与末尾13位犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）的羧基生成酯键，形成含10个氨基酸的环肽;1位色氨酸（Tryptophan ，Trp）的N 末端与十碳脂肪酸形成酰胺键，封闭了肽段的N端^[3];分子中包括3个非蛋白源的特殊氨基酸：鸟氨酸（Ornithine， Orn）， 3-甲基谷氨酸（3-Glutamic acid，3-mGlu）和Kyn ^[4]。化学结构见图1。

达托霉素的结构确证难点是需同时确证环肽的氨基酸序列和环上的脂肪酸链结构，尤其还包含多个非天然氨基酸。目前，国内对达托霉素的研究报道多集中在提取、分离、合成和抗菌活性上[5～7]，未见对其结构鉴定。虽然，对其结构鉴定已有文献报道^[8]，但是多采用核磁共振法，而核磁共振法具有样品用量大、解谱复杂、分析时间长等缺点。近年来质谱技术得到了广泛的应用和发展，基于软电离技术的ESI质谱和基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）是两种最常用的生物质谱，是蛋白质和多肽结构确证的重要手段[9，10]。 本研究利用MALDI和ESI质谱成功地对达托霉素进行了一级结构确认，方法简便、快速，可为环脂肽类抗生素药物结构分析提供参考。

2 实验部分

2.1 仪器与材料

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/TOF），micrOTOF-QTMⅡ质谱仪（Bruker公司）; 注射泵（Harvard公司）; C18-ZipTip脱盐柱（Millipore公司）。 α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-CHCA，Fluka公司）; 乙腈（ACN，Fisher公司）; 三氟乙酸（TFA）和甲酸（FA）（Sigma公司）;  LiOH（国药集团化学试剂有限公司）; 达托霉素（华北制药股份有限公司）; Milli-Q超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 样品直接ESI-MS/MS测定 称取样品干粉适量配成0.01 mol/L 的样品溶液，取样品溶液15μL，经ZipTip柱脱盐后， 用0.1% FA溶液稀释到0.01 g/L，用100 μL直喷进样。

2.2.2 样品开环及MS/MS检测 取0.01 mol/L样品溶液10 μL， 加入90 μL 0.025 mol/L LiOH溶液，混匀，分别在20和25 ℃下反应0.5， 1， 1.5， 2和3 h。取各反应溶液0.5 μL 点靶，室温风干后覆盖α-CHCA基质（5 g/L， 含0.1%TFA的50%ACN溶液），MALDI-TOF/TOF检测。对最佳开环条件下的样品反应液经ZipTip柱脱盐后， 用0.1% FA溶液稀释至0.01 g/L，取100 μL ESI直喷进样。

2.2.3 仪器参数 （1）MALDI-TOF/TOF MS仪： 加速电压18.2 kV;离子源电压20 kV;N2 激光，波长337 nm，能量3500，PII标准品校正至误差在0.1 Da以内，串联质谱检测能量4000，PII标准品离子峰m/z 1046.540校正至误差0.05 Da以内。 （2）ESI-MS/MS直喷进样仪：源温180 ℃，采集范围： m/z 50～ 2500，扫描速度： 0.5 s/次，串联质谱碰撞能量： 20～50 eV。数据分析软件为Data Analysis 4.1（Bruker）。

3 结果与讨论

3.1 达托霉素环外氨基酸序列的确定

ESI测定达托霉素的相对分子量为1619.7107，与其元素组成C72H101N17O26计算所得的理论单同位素相对分子量1619.7100的偏差为0.0007，样品实测分子量与理论分子量一致。

选择达托霉素双电荷峰m/z 809.848作为母离子进行ESI-MS/MS测序，质谱图见图2。

达托霉素含3个非蛋白源的特殊氨基酸，根据图1确定特殊氨基酸残基的元素组成后， 计算其单同位素相对分子量，计算得出Orn， 3-mGlu和Kyn残基的单同位素相对分子量分别为114.0794， 143.0615和190.0742。另外，1位的Trp经脂肪酸链“C9H19CO”修饰，其残基相对分子量由C9H19CO和Trp残基两部分组成，值为341.2228。由于达托霉素含有环肽，软件无法解析碎片。 人工解析的结果表明，达托霉素y10， y11， y12， b1， b2离子均被匹配，并且还匹配到a1离子、Trp残基、达托霉素、y12离子及达托霉素的失水峰，确定出达托霉素环外氨基酸序列为C9H19CO-Trp-Asn-Asp。endprint

3.2 开环达托霉素氨基酸序列的确定

直接ESI-MS/MS未成功解析达托霉素环内氨基酸序列，因此对其开环裂解。达托霉素环肽上的酯键可通过LiOH溶液温和地水解，形成线性肽，相对分子量相应地增加18.0106。MALDI-TOF/TOF-MS耐盐能力强、分析速度快、图谱简单、适合通量分析，利用其监测达托霉素开环程度十分有益。控制达托霉素的终浓度为0.001 mol/L，LiOH的终浓度为0.02 mol/L，在20和25 ℃下反应不同时间，以开环产物与未开环样品的峰高之比评价开环效果。结果表明， 25 ℃反应1.5 h开环最完全，开环产物峰高约为未开环样品峰高的10倍，超过95%的达托霉素已开环。此条件与文献[11]基本一致。

选择开环产物的双电荷峰m/z 819.854进行ESI-MS/MS测序，质谱峰去卷积化后运用Biotools Version3.2软件进行碎片离子归属， 肽段序列结果如图4所示。由于Orn， 3-mGlu， Kyn及N-端被脂肪酸封闭的Trp在Biotools Version3.2中不存在，因此，将这4个氨基酸残基用软件中相似的常见氨基酸残基进行自定义修饰演变。Orn演变为Lys去掉CH2，残基质量为128.0950-14.01564，在序列中标记为K*;3-mGlu演变为Glu加上CH2，残基质量为129.0459+14.01564，标记为E*，Kyn演变为Phe加上CONH，其残基质量为147.0684 + 43.0058，标记为F*;N-端被脂肪酸封闭的Trp演变为Trp加上C10H19O， 残基质量为186.07931 + 155.1435，标记为W*。测序结果表明，b、y离子均连续匹配，所有匹配离子的误差均小于0.04 Da（表1），所测环内外氨基酸序列结果与达托霉素理论序列一致。两种质谱检测结果相互验证，达托霉素氨基酸序列正确，开环后序列为 W*-N-D-T-G-K*-D-A-D-G-S-E*-F*，即：

3.3 达托霉素脂肪酸链结构确定

上述两种串联质谱均检测到b1离子，其由Trp残基和脂肪酸链C9H19-CO两部分组成。对于饱和十碳脂肪酸链C9H19-CO的结构确认重点是看其是否含有支链并确定支链的类型及位置，这需从串联质谱的低质量端离子碎片数据解析。为获得丰富的低端（m/z 341以下）碎片信息，优化了干燥气体的流速、气体温度、离子源温度及碰撞能量等质谱参数。结果表明，对质谱信号影响最大的是碰撞能量，与文献[12]报道一致。在碰撞能量为40 eV的条件下，质谱信号较好，碎片较多，检测结果见图5A。检测到脂肪酸结构相关的碎片离子有m/z 326.20， 284.15， 270.14， 256.12， 230.11， 170.15及155.14，其中离子强度最大的为230.11。

将b1离子看作C9H19-CO-的酰胺类衍生物，文献[13，14]报道称脂肪酸的酰胺类衍生物质谱裂解规律同脂肪酸甲酯类有机物一致，而现有文献对脂肪酸甲酯类有机物的质谱裂解规律较多，可类推到本研究达托霉素b1离子。直链饱和脂肪酸甲酯通过γ氢迁移和Mclafferty重排，生成的碎片离子[CH3-O-C（OH）= CH2]+ （m/z 74）为其基峰离子^[15，16]。将甲酯基“-O-CH3”换成Trp残基，碎片离子的理论m/z为 230.1，实测值中m/z 230.11是脂肪酸链结构相关的强度最大的碎片离子，可判断出达托霉素C9H19-CO为直链型。文献[16]还报道，若饱和脂肪酸含有支链，则在支链处易发生断裂。若甲基为支链，则会产生两个较强的碎片离子，其相差[-CH（CH3）-]（m/z 28） 。实测值m/z 284.15与256.12相差28.03，然而这两峰的峰强较低，尤其m/z 256.12峰强低于m/z 270.14 和170.15，这说明m/z 284.15与 256.12两碎片离子相差的是[-CH2CH2-]，没有支链。根据以上结果，推断出达托霉素

b1离子的断裂模式（图5B），直观表达了托霉素脂肪酸链的质谱断裂规律。

本研究采用两种生物质谱MADI-TOF/TOF和ESI-Q-TOF，从分子量、氨基酸序列及脂肪酸链结构的角度对达托霉素进行了快速结构确证，实现了对含有非蛋白源的环肽氨基酸序列和脂肪酸链结构的同时解析，对于环脂肽类抗生素药物结构分析具有参考意义。

References

1 Tally F P， DeBruin M F. J. Antimicrob. Chemother.， 2000， 46（4）： 523-526

2 Tedesco K L， Rybak M J. Pharmacotherapy，  2004，  24（1）： 41-57

3 Muangsiri W， Kirsch L E. J. Pharm. Sci.，  2001，  90（8）： 1066-1075

4 Baltz R H. J. Antibiot.，  2010，  63（8）： 506-511

5 GU Jue-Fen， ZHANG Yu. Anti. Infect. Pharm.，  2011，  8（3）： 149-153

顾觉奋， 张 瑜. 抗感染药学， 2011，  8（3）： 149-153

6 HAN Pei， CHEN Ji-Ye， WANG Yan， CHEN Shao-Xin. Chinese Journal of Pharmaceuticals，  2011，  42（6）： 466-471endprint

韩 培， 陈继业， 王 岩， 陈少欣.  中国医药工业杂志，  2011，  42（6）： 466-471

7 LIU Bo-Ning， CANG Ji-Yong， ZHANG Hua. China Biotechnology，  2010，  30（3）： 119-124

刘伯宁， 仓基勇， 张 华.  中国生物工程杂志，  2010，  30（3）： 119-124

8 Scott W R， Baek S B， Jung D， Hancock R E， Straus S K. Biochim. Biophys. Acta.，  2007，  1768（12）： 3116-3126

9 CHEN Jun， YIN Jun， GAO Shuai， XU Li， XIAO Hong-Zhan. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（3）： 421-426

陈 君， 殷 俊， 高 帅， 许 莉， 肖宏展. 分析化学， 2012， 40（3）： 421-426

10 LI Guo-Chen，WANG Yan-Hong， WU Ren-An， WANG Shi-Cheng. Chem. J. Chinese Universities， 2010， 31（2）：  269-273

李国琛， 王颜红， 吴仁安， 王世成. 高等学校化学学报，2010， 31（2）： 269-273

11 D′Costa V M， Mukhtar T A， Patel T， Koteva K， Waglechner N， Hughes D W， Wright G D， de Pascale G. Antimicrob. Agents. Chemother.，  2012，  56（2）： 757-764

12 Thurman E M， Ferrer I， Benotti M， Heine C E. Anal. Chem.，  2004，  76（5）： 1228-1235

13 XING Qi-Yi， PEI Wei-Wei， XU Rui-Qiu， PEI Jian. Basis of Organic Chemistry.  Higher Education Press， 2005：  231-233

邢其毅， 裴伟伟， 徐瑞秋， 裴 坚.  基础有机化学.  高等教育出版社， 2005：  231-233

14 YU Zhi-Li， WANG Yan-Yun. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society，  1999，  20（1）： 57-60

余志立， 王燕云.  质谱学报，  1999，  20（1）： 57-60

15 WU Hui-Qin， HUANG Xiao-Lan， LIN Xiao-Shan， HUANG Fang， ZHU Zhi-Xin， MA Ye-Fen. Chinese J. Anal. Chem.，  2007，  35（7）： 998-1003

吴惠勤， 黄晓兰， 林晓珊， 黄 芳， 朱志鑫， 马叶芬.  分析化学，  2007，  35（7）： 998-1003

16 LOU Qiao-Ming， YANG Wen-Ge， XU Da-Lun， ZHENG Xian-Meng， XUE Chang-Hu. Journal of Nuclear Agricultureal Sciences.，   2013，  27（3）： 334-339

楼乔明， 杨文鸽， 徐大伦， 郑贤孟， 薛长湖.  核农学报，  2013，  27（3）： 334-339

Fast Structure Confirmation of Daptomycin by Matrix-assisted

Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry and

Electrospray Ionization Mass Spectrometry

HUANG Ya-Juan1，2， ZHANG Tuo1，2， HAN Zhi-Guo1，2， MENG Xiao-Guang1，2，

SONG Chun-Yan1，2， LIU Shu-Chen3， ZHENG Jun-Jie*1，2，3， WEI Kai-Hua*1，2，3

1（Beijing C&N International Sci-tech Co.， Ltd， Beijing 102206， China）

2（Beijing Proteome Research Center， State of Key Laboratory of Proteomics，

National Center for Protein Sciences （Beijing）， Beijing 102206， China）

3（Beijing Institute of Radiation Medicine， Military Medical Science Academy ofendprint

China People′s Liberation Army， Beijing 100850， China）

Abstract Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight tandem mass spectrometry （MALDI-TOF/TOF MS） and electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometry （ESI-Q-TOF MS） were used to confirm the structure of cyclic lipopeptide daptomycin fastly. First， the relative molecular weight 1916.7107 of daptomycin was measured by ESI with error 0.0007. The samples doubly charged peak m/z 809.848 was selected as precursor ion for ESI-MS/MS analysis， and the exocyclic amino acid sequence C9H19CO-Trp-Asn-Asp was successfully matched. Second， the experimental conditions of cleaving daptomycin by lithium hydroxide （LiOH） were optimized and the ring-opened process was monitored by MALDI-TOF/TOF MS. After obtaining ring-opened product with purity of above 95%， the MS/MS measurements by MALDI and ESI were carried out. The b+ and y+ of ring-opened product were completely matched， which confirmed the amino acid sequence of daptomycin. Finally， ESI-MS/MS conditions of ring-opened product were further optimized to obtain more low mass fragment ions for analyzing the structure of fatty acid chain and the cleavage pattern of fat chain in mass spectrometry was proposed. The method was fast， convenient， accurate and reliable for identifying cyclic lipopeptide compounds.

Keywords Daptomycin; Cyclic lipopeptide; Tandem mass spectrometry; Electrospray ionization mass spectrometry

（Received 30 April 2014; accepted 22 September 2014）

This work was supported by the National High Technology Research and Development Program 863（Nos. 2012AA020205， 2014AA020906）， the Ministry of Science and Infectious Diseases of Major Projects （No.2013ZX10002009-001-001）， and the National Major Scientific Ruments and Equipments Special Project （No.2012YQ18011710）endprint