云南普洱瓢鸡、腾冲雪鸡GRX1、TRX1基因差异性表达

李美荃，宋 聪，张春勇，安清聪，潘洪斌，陈克嶙，郭荣富

（云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明650201）

在云南高原立体环境下，自繁自养的本地鸡种通过生物进化形成了独特的优质特性。云南地方鸡种肉香味美、肉质细嫩，抗病力强，抗氧化特性较培育鸡种高。谢强明等研究报道，普洱瓢鸡生长在海拔较高、气候冷凉的山区，具有体型矮小细致的体征特点，瓢鸡腹脂较厚、易于沉积脂肪，肉味细嫩鲜美［1］。沈雪鹰等调查报道，腾冲雪鸡产于冬季积雪的高黎贡山西麓，羽毛洁白、肉骨乌黑，肉质鲜美香甜，腾冲雪鸡对一般疾病如鸡白痢、球虫病有较强的抵抗力，是我国地方优良鸡种［2］。谷氧还蛋白（glutaredoxin，GRX）和硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）是抗氧化酶系统和抗氧化非酶系统的重要成员，在抗氧化系统中发挥重要的作用，具有维持细胞内的氧化还原稳态、抗衰老及肠道保护生物学效应等作用［3］。Lundberg等［4］报道，GRX 家族逐渐扩大，新的GRX 成员不断被发现，如谷氧还蛋白1（GRX1）、谷氧还蛋白2（GRX2）。Kim M J等研究报道，1型半胱氨酸的cMsrA 是通过GRX 再生的［5］。目前在硫氧还蛋白家族（TRXs）中，主要有TRX1 和TRX2两型，在细胞抗氧化能力方面发挥重要作用。本试验旨在探讨不同鸡种间抗氧化基因的差异，为提高其抗氧化能力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验以云南特有同日龄健康普洱瓢鸡、腾冲雪鸡为研究对象，以三黄鸡为试验对照，相同日粮和饲养管理条件，鸡场实施正常免疫程序和饲养管理。每个试验鸡种各随机取12只体重相近的鸡（1／2♂；1／2♀），共36只试验鸡屠宰备用。

1.2 样品收集

采用颈部错位法屠宰试验鸡，屠宰后立即取其十二指肠、回肠、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、皮肤、肌肉共八个组织，于－80 ℃低温冰箱保存备用。

1.3 RT－PCR

1.3.1 不同品种鸡组织总RNA 提取和反转录使用TRIzol法提取组织RNA（按照说明书操作），并用琼脂糖凝胶电泳检测法和分光光度计检测法进行质量检测。采用PrimeScript RT Master Mix反转试剂盒进行反转录，cDNA 置于－20 ℃保存。

1.3.2 引物设计 RT－PCR 扩增引物根据Gen－Bank提供的mRNA 序列使用Primer Premier（5.0）软件设计，如表1所示。由上海生工生物工程设计服务有限公司合成。

表1 qRT－PCR引物信息Table 1 Information of Primers used for qRT－PCR

1.3.3 实时荧光定量PCR 采用Eva GreenⅠ染料法，反应在Bio－Rad CFX96TM Real－Time PCR Systems上进行。反应体系为20μL：SsoFastTM EvaGREEN○RSupermix 10μL（BIO－RAD，美国），上下游引物（10μmol／L）各1.0μL，cDNA 模板2.0 μL，加灭菌去离子水至20μL。样品分装于96孔板（BIO－RAD，美国）中，可透光盖（BIO－RAD，美国）盖紧。TRX1反应条件为：95 ℃，10 min；95 ℃、5s，57 ℃、20s，72 ℃、15s，40个循环。GRX1反应条件为：95 ℃，10min；95 ℃、5s，59 ℃、20s，72 ℃、15s，40个循环。

1.4 数据分析

所有组织低氧适应基因的表达量均是以GAP－DH、18s、β－actin为内参基因，最终以相对表达量来表示，相对荧光定量计算方法采用Pfaffl M.W.［6］方法计算而来。所有数据均采用Excel进行整理，采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 TRX1与GRX1品种间基因表达差异

普洱瓢鸡、腾冲雪鸡所有组织的TRX1、GRX1基因mRNA 表达量高于三黄鸡，普洱瓢鸡大部分组织的TRX1、GRX1基因mRNA 表达量高于腾冲雪鸡（图1）。

图1 普洱瓢鸡、腾冲雪鸡、三黄鸡TRX1（a），GRX1（b）基因的差异表达Fig.1 Difference of TRX1（a），GRX1（b）gene expression in Puerpiao，Tengchongxue and Sanhuang chicken

2.2 TRX1与GRX1组织间基因表达差异

普洱瓢鸡、腾冲雪鸡、三黄鸡所有组织中TRX1基因mRNA 表达量都远远高于GRX1基因mRNA表达量（如图2 所示）。其中，肾脏中的TRX1、GRX1表达差异最为显著（P＜0.01）。普洱瓢鸡组织的TRX1基因mRNA 表达量最高的是肾脏和肝脏，表达量最低的是心脏和肌肉，差异极显著（P＜0.01）。普洱瓢鸡组织的GRX1 基因mRNA 表达量最高的是肺脏和肝脏，表达量最低的是心脏和肌肉，差异极显著（P＜0.01）。腾冲雪鸡组织的TRX1基因mRNA 表达量最高的是肾脏和肺脏，表达量最低的是回肠和肌肉，差异极显著（P＜0.01）。腾冲雪鸡组织的GRX1 基因表达量最高的是肝脏和十二指肠，表达量最低的是肌肉和心脏，差异极显著（P＜0.01）。三黄鸡组织的TRX1 基因mRNA表达量最高的是肾脏和肺脏，表达量最低的是回肠和肌肉，差异极显著（P＜0.01）。三黄鸡组织的GRX1基因mRNA 表达量最高的是十二指肠和回肠，表达量最低的是皮肤和肌肉，差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论

3.1 TRX1、GRX1的抗氧化应激生物学效应

细胞内的氧化还原状态与细胞分化、细胞免疫、生长抑制、肿瘤发生以及凋亡密切相关［7］。GRX 是由Holmgren等在缺失TRX 基因的大肠杆菌中首次发现的，是一类依赖GSH 的氧化还原酶，在细胞内氧化还原平衡状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用［8］。TRX 于1964年在大肠杆菌中首次被发现，是一种内生的抗氧化剂，在组织的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶被耗尽后可能发挥关键性作用［9］。GRX 和TRX 在细胞分化、细胞免疫、生长抑制、肿瘤以及细胞凋亡等过程中发挥着重要的抗氧化作用［10］。

图2 普洱瓢鸡TRX1、GRX1（a）、腾冲雪鸡TRX1、GRX1（b）、三黄鸡的TRX1、GRX1（c）基因表达差异Fig.2 Difference of GRX1and TRX1gene expression for Puerpiao（a），Tengchongxue（b），Sanhuang（c）chicken

3.2 TRX1、GRX1基因在不同品种间的差异表达

本地鸡种普洱瓢鸡、腾冲雪鸡的TRX1、GRX1含量显著高于三黄鸡；而云南地方鸡种腾冲雪鸡和普洱瓢鸡之间，其TRX1、GRX1的含量与普洱瓢鸡也存在差异，普洱瓢鸡大部分组织的TRX1、GRX1基因mRNA 表达量高于腾冲雪鸡。普洱瓢鸡生长在海拔较高、气候冷凉的山区，由于长期处于小群封闭、自繁自养状态，没有外来鸡种的混杂，通过长期的自然选择和人工选择而成。腾冲雪鸡产于山顶常年积雪的高黎贡山西麓，是云南省优良地方鸡种资源［11］。由于云南高海拔低氧气候，地方鸡种为了适应缺氧环境故其抗氧化能力强于培育鸡种三黄鸡。

3.3 TRX1与GRX1基因表达差异

GRX 作用于抗氧化酶系统，TRX 作用于抗氧化非酶系统［12］。动物机体内的抗氧化酶物质大都属于大分子物质，非酶系统主要包括维生素C、谷胱甘肽等小分子物质［13］。试验结果显示，普洱瓢鸡、腾冲雪鸡、三黄鸡所有组织的TRX1基因的mRNA表达量比GRX1 基因的mRNA 表达量高，但动物机体内抗氧化物质作用机理复杂，因此并不能说明动物机体内TRX1 的抗氧化作用大于GRX1。TRX1和GRX1的作用机理还有待进一步研究。

3.4 TRX1、GRX1基因在不同组织间表达差异

肾脏是对氧化应激高度敏感的器官之一，ROS对肾脏有直接的损伤作用。细胞中的活性氧是导致生物氧化胁迫的一个主要方面。而TRX 与硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及NADPH 共同组成硫氧还蛋白系统参与众多生理过程［14］。TRX 可以通过对细胞内被氧化的二硫键的还原来修复机体的氧化损伤［15］。动物机体内通过大量表达TRX1 使肾脏免于氧化应激损伤［16］。Sugama K 等报道TRX 与肾小管损伤有关，且影响IL－10水平［17］。本试验结果显示普洱瓢鸡、腾冲雪鸡、三黄鸡的肾脏内的TRX1 含量高于其他组织，而GRX1表达与其他组织差异不明显，可说明在肾脏内参与抗氧化的蛋白质主要是TRX。大量ROS产生会造成组织细胞的损害，而肺脏是最易受损的靶器官之一。其中ROS可与蛋白质中的色氨酸、组氨酸和半胱氨酸等残基反应，破坏蛋白质的一级结构和功能，使含有这些氨基酸的蛋白质、酶和受体等功能受损［18］。GRX 催化依赖谷胱甘肽的二硫化物氧化还原过程，通常发生在GRX 上被其他氨基酸隔开的两端半胱氨酸上［19］，半胱氨酸的表达直接影响谷氧还蛋白的表达与作用。ROS引起的肺损伤攻击半胱氨酸，导致谷氧还蛋白表达低。Cao等研究报道，GGA 能够保护由TRX 引起的肺脏缺血再灌注损伤［20］。本试验结果显示，瓢鸡的GRX1表达高于雪鸡与三黄鸡的，与常规检测结果相一致，瓢鸡肺脏受ROS攻击最小。为了维持肺脏的基本功能和氧化还原平衡，抵制ROS对半胱氨酸的攻击，故而肺脏的GRX1含量相较其他组织要高。

肝脏在代谢过程中可不断产生一些氧化活性物质（ROS）。肝脏的抗氧化防御系统有四类：酶促防御机制、硫氧化还原蛋白和过氧化还原蛋白、低分子量的抗氧化剂和金属结合蛋白［21］。谷氧还蛋白系统主要存在于胞浆和线粒体中，硫氧还蛋白还原系统主要存在于包浆中。故而肝脏的GRX1、TRX1表达较之其他组织要高很多，其在氧化还原中具有重要意义。Qin 等报道，高脂饮食诱导的肝损伤，TRX／TrxR 系统是其产生氧化应激的主要因素［22］。

肠道是动物消化和吸收营养物质的功能性器官，同时它还具有内分泌、免疫、粘膜屏障等作用［23］。同时肠道是ROS产生的主要场所，肠道系统的炎症反应通常会降低畜禽机体的抗氧化能力，从而引起某些营养物质的吸收障碍，尤其是在脂溶性维生素的吸收方面［24］。肠粘膜本身含有高浓度的非蛋白质巯基，自由基作用于巯基导致蛋白质变性、酶失活，自由基还能与膜内的多不饱和脂肪酸结合造成脂质过氧化损害［25］。因此，在畜禽养殖业中，肠道是极易造成过氧化损伤的器官之一。与其他器官相比，肠道的GRX1、TRX1表达量相对较低也显示肠道的过氧化损伤相对较严重。

4 结论

普洱瓢鸡的GRX1、TRX1基因mRNA 表达水平高于腾冲雪鸡，腾冲雪鸡的GRX1、TRX1 基因mRNA 表达水平显著高于三黄鸡。普洱瓢鸡、腾冲雪鸡各组织中的TRX1、GRX1的表达量均高于三黄鸡；TRX1 在三个鸡种中的表达量显著高于GRX1，其机制有待于进一步研究。

［1］谢强明，杨柳平.普洱瓢鸡资源调查报告［J］.云南畜牧兽医，2009，（4）：17－18.

［2］沈雪鹰，尹玉安.腾冲雪鸡资源调查报告［J］.中国家禽，1999，21（2）：8－9.

［3］黄金昌，郭荣富.谷氧还蛋白和硫氧还蛋白对动物抗氧化应激生物学效应的研究进展［J］.动物营养学报，2010，22（4）：845－850.

［4］Lundberg M，Johansson C，Chandra J，et al.Cloning and expression of a novel human glutaredoxin（GRX2）with mitochondrial and nuclear isoforms［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276（28）：26 269－26 275.

［5］Kim M J，Jeong J，Jeong J，et al.Mechanism of 1－Cys type methionine sulfoxide reductase A regeneration by glutaredoxin.Biochem Biophys Res Commun［J］.2015，457（4）：567－571.

［6］Pfaffl M W.A new mathematical model for relative quantification in real－time RT－PCR［J］.Nucleic acids research，2001，29（9）：45.

［7］Holmgren A.Hydrogen donor system for Escherichia coli ribonucleoside－diphosphate reductase dependent upon glutathione［J］.PNAS，1976，73（7）：2 275－2 279.

［8］Daily D，Vlamis－Gardikas A，Offen D，et al.Glutaredoxin protects cerebellar granule neurons from dopamine－induced apoptosis by activating NF－kappa B via Ref－1［J］.J Biol Chem，2001，276（2）：1 335－1 344.

［9］Powis G，Montfort W R.Properties and biological activities of thioredoxins［J］.Annu Rev Biophys Biomol Struct，2001，30（1）：421－455.

［10］Damdimopoulos A E，Miranda－Vizuete A，Pelto－Huikko M，et al.Human mitochondrial thioredoxin.Involvement in mitochondrial membrane potential and cell death［J］.J Bio Chem，2002，277（36）：33 249－33 257.

［11］李久强.腾冲雪鸡生态养殖技术［J］.当代畜牧，2012（5）：3.

［12］Haapasalo H，Kylaniemi M，Paunul N，et al.Expression of antioxidant enzymes in astrocytic brain tumors［J］.Brain Pathol，2003，13（2）：155－164.

［13］Van Laer A，Dallalio G，McKenzie S W，et al.Thioredoxin and protein nitrotyrosine in bone marrow supermatant from patients with human immunodeficiency virus infection［J］.J Investing Med，2002，50（1）：10－18.

［14］Yoo C W，Song C Y，Kim B C，et al.Glycated albumin induces superoxide generation in mesangial cells［J］.Cell Physiol Biochem，2004，14（4－6）：361－368.

［15］Kitada M，Koya D，Isono M，et al.Translocation of glomerular p47phox and p67phox by protein kinase C－beta activation is required for oxidative stress in diabetic nephropathy［J］.Diabetes，2003，52（10）：2 603－2 614.

［16］Gojo A，Uesunomiya K，Taniguchi K，et al.The Rho－kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin－induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2007，568（1－3）：242－247.

［17］Sugama K，Suzuki K，Yoshitani K，et al.Changes of thioredoxin，oxidative stress markers，inflammation and muscle／renal damage following intensive endurance exercise［J］.Exerc Immunol Rev，2015（21）：130－142.

［18］Hibi M，Lin A，Smeal T，et al.Identification of an oncoprotein－and UV－responsive protein kinase that binds and potentiates the c－Jun activation domain［J］.Genes Dev，1993，7（11）：2 135－2 148.

［19］Song J J，Lee Y J.Differential role of glutaredoxin and thioredoxin in metabolic oxidative stress－induced activation of apoptosis signal－regulating kinase 1［J］.Biochem J，2003，373（Pt 3）：845－853.

［20］Cao W，Li M，Li J，et al.Geranylgeranylacetone ameliorates lung ischemia／reperfusion injury by HSP70and thioredoxin redox system：NF－kB pathway involved［J］.Pulm Pharmacol Ther.2015，32（6）：109－115.

［21］Nobili V，Pastore A，Gaeta L M，et al.Glutathione metabolism and antioxidant enzymes in patients affected by nonalcoholic steatohepatitis［J］.Clin Chim Acta，2005，355（1－2）：105－111.

［22］Qin H，Zhang X，Ye F，et al.High－fat diet－induced changes in liver thioredoxin and thioredoxin reductase as a novel feature of insulin resistance［J］.FEBS Open Bio，2014，4（10）：928－935.

［23］Yesilova Z，Yaman H，Oktenli C，et al.Systemic markers of lipid peroxidation and antioxidants in patients with nonalcoholic Fatty liver disease［J］.Am J Gastroenterol，2005，100（4）：850－855.

［24］袁施彬，陈代文，余 冰，等.氧化应激对断奶仔猪生产性能和养分利用率的影响［J］.中国饲料，2007（8）：19－22.

［25］Zheng P，Yu B，Lv M，et al.Effects of oxidative stress induced by Diquat on arginine metabolism of postweaning pigs［J］.Asian－Australian Journal of Animal Sciences，2010，23（1）：98－105.