星点设计—效应面优化牛大力多糖提取工艺

陈勇　谢臻　巫繁菁　等

摘要：利用星点设计-效应面法对牛大力多糖的提取工艺进行优化。以提取温度、提取时间和料液比为自变量，多糖提取率为因变量，通过对自变量各水平的多元线性回归及二项式拟合，用星点设计-效应面法选取最佳工艺。试验结果表明最佳工艺条件为89.3 ℃，料液比1∶32（g/mL），提取106 min，在此条件下测得多糖含量为558.5 mg/g，与预测值554.6 mg/g较接近。

关键词：星点设计；效应面；牛大力；多糖

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5507-04

牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia sliaopeciosa Champ.）的根[1]，俗称山莲藕、血藤、九龙串珠、牛古大力、大力薯[2]。性味甘平，具有补虚润肺、强筋活络的功效，临床证明对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺结核、慢性支气管炎等有一定疗效[3]。牛大力的主要化学成分为苯丙素类、三萜类化合物、植物甾醇、多糖等[4]。现代药理试验研究结果表明，牛大力具有镇咳平喘、抗肝纤维化作用，其多糖成分还具有调节免疫功能作用[5-9]。本试验采用加热回流提取，以多糖提取率为指标，采用星点设计-效应面法优化了牛大力的提取工艺，确定了最佳提取工艺，为充分利用牛大力资源，及其质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛大力药材购于玉林中药材市场，部分采自广西靖西县，并经广西中医药大学朱意麟老师鉴定为豆科植物美丽崖豆藤的根。

Agilent8453型紫外-可见分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）、BP211D型电子分析天平（德国赛多利斯），水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 牛大力多糖含量测定

1）标准品溶液制备。精密称取干燥至衡重的葡萄糖粉末12.57 mg，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。

2）供试品溶液制备。取牛大力药材粉末0.5 g，置于250 mL的锥形瓶中，加入去离子水32 mL，89.3 ℃加热回流106 min，滤过，吸取滤液5 mL，加入无水乙醇20 mL不断搅拌使之含醇量达到80%，得到均匀乳白色沉淀，放入冰箱静置过夜。将沉淀用无水乙醇冲洗至析晶漏斗上，抽滤，弃去乙醇液。用沸水将漏斗上的多糖结晶溶解抽滤至50 mL容量瓶中，定容。

3）最大吸收波长。取葡萄糖标准品适量置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。在冰水浴中加入0.05%硫酸-蒽酮4.0 mL，静置10 min，取出摇匀，沸水浴10 min后取出，冷却，室温放置30 min后，以相应试剂作空白，在400～800 nm测定光谱图，葡萄糖标准品紫外可见光谱图见图1，同法操作，牛大力供试品溶液紫外可见光谱图见图2，全波长扫描，葡萄糖标准品溶液与牛大力供试品溶液的最大吸收波长均为628 nm，所以选择此波长为测定波长。

4）标准曲线测定。取上述标准品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL至具塞试管中并加去离子水至1.0 mL。在冰水浴中加入0.05%硫酸-蒽酮4.0 mL，静置10 min，取出摇匀，沸水浴10 min后取出，冷却，室温放置30 min，在628 nm处测定其吸光度，以1.0 mL去离子水为空白，记录各吸光度并绘制标准曲线。

1.2.2 单因素试验 多糖溶于水而不溶于高浓度乙醇，因此先用80%乙醇去除影响多糖含量的物质。再用水加热回流提取多糖，考察提取温度（40、50、60、70、80、90、100 ℃）、提取时间（20、40、60、80、100、120、140 min）、料液比（g/mL，下同）（1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40）3个因素对多糖提取率的影响。

1.2.3 星点试验设计 因提取次数为非连续变量，不能进行回归处理，固定提取1次。根据星点试验设计的原理，结合单因素考察结果，以提取温度、提取时间和料液比作为影响牛大力多糖含量的提取因素。每个因素设有5水平，因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线见图3。由图3可知，葡萄糖标准品在0.007 542～0.020 112 mg/mL间呈线性关系，计算回归方程为y=32.83x+0.038 3，r=0.999 3。

2.2 指标测定结果

2.2.1 精密度试验结果 取同一标准品连续测定6次，吸光度平均值为0.600 81，RSD为0.46%，取同一供试品溶液连续测定6次，吸光度平均值为0.600 8，RSD为0.46%，表明本法精密度良好，。

2.2.2 稳定性试验结果 取供试品溶液1份，每隔10 min测定吸光度，结果表明显色后在60 min内较稳定，RSD为0.51%。

2.2.3 重复性试验结果 取同一批次样品6份，测定吸光度，其多糖含量平均值为553.835 4 mg/g，RSD为2.90%，表明本方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验结果 取已知含量本品适量，精密加入葡萄糖标准品适量，测定吸光度，平行测量6份样品，计算加样回收率为102.20%，RSD为1.70%。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取温度 取牛大力药材粉末0.5 g分别在40、50、60、70、80、90、100 ℃下提取并测定多糖提取率，结果见图4。由图4可知，随着温度的升高，多糖溶出量逐渐增大，在100 ℃提取率达到最大值。

2.3.2 提取时间 取牛大力药材粉末0.5 g分别提取20、40、60、80、100、120、140 min，提取1次，测定多糖提取率，结果见图5。由图5可知，随着提取时间的延长，多糖提取率增长缓慢，在120 min后随着时间的延长，多糖提取率略有下降，从节省能源、减少时间周期考虑，提取时间以120 min左右为宜。

2.3.3 料液比 取牛大力药材粉末0.5 g，按照料液比分别为1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40添加溶剂并测定多糖提取率，结果见图6。由图6可知，多糖提取率随着料液比的降低而增加，1∶36时提取率最高，多糖基本提取完全，增加溶剂对多糖提取率影响较弱，因此选择料液比1∶36左右为宜。

2.4 星点试验结果

星点试验结果见表2。将所得数据用统计分析软件进行响应面分析。本次试验响应曲面待拟合的方程为：Y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x12+b5x22+b6x32+b7x1x2+b8x1x3+b9x2x3。应用STATISTICA 7.0软件包对按星点设计矩阵获得的试验数据进行多元回归与方差分析，得到优化后的二项式方程：

Y=498.819 8+142.820 6x1-99.847 3x12-72.185 7x22+49.557 49x1x2-41.547 1x1x3-40.603 7x2x3（r=0.904 3）。由此可见，有90.43%多糖含量归因于这3个因素的变化，只有9.57%不被此方程所解释。

根据拟合的二项式方程，绘制多糖随因素变化的响应面图，确定牛大力多糖的最佳工艺条件，结果见图7至图9。对二项式方程进行求导，可得：当提取条件为在89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，提取1次时，Y有预测的最大值554.6 mg/g。依据最佳提取工艺条件提取牛大力，设置3个重复进行验证试验，测得多糖含量为558.5 mg/g。

3 小结与讨论

响应面法是通过建立响应值与被考察因素的函数关系，从响应面上选择最佳的响应值，从而推出自变量取值范围即最佳试验条件的方法。因此，本试验必须采用单因素考察，方可确定合理的试验条件。近年国内较多利用星点设计试验所得的信息量大、直观的优点应用于优化中药提取工艺[10，11]。因此本研究采用星点设计的方法设计试验矩阵，对牛大力中多糖的提取工艺进行优化，将拟合得到的二项式方程进行求导，计算多糖含量最高时各个被考察因素的取值。最终确立牛大力的最佳提取条件为89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，在此条件下，多糖的实际含量为558.5 mg/g，与预测值554.6 mg/g较接近。

参考文献：

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[2] 黄泰康，丁志遵，赵守训.现代本草纲目（上册）[M].北京：中国医药科技出版社，2001.

[3] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编（上册）[M].第三版.北京：人民卫生出版社，1986.

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[5] 王春华，王 英，王国才，等.牛大力的化学成分研究[J].中草药，2008，39（7）：972-975.

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[7] 赖富丽，王祝年，王建荣，等.牛大力藤叶脂溶性成分的GC-MS分析[J].热带作物学报， 2009， 30 （5）：714 .

[8] 李 移，陈 杰，李尚德.中药牛大力微量元素含量的测定[J].广东微量元素科学，2008，15（2）：56.

[9] 吕世静，黄槐莲，吴宋厦.牛大力对抗体及IL-2产生的影响[J].上海免疫学杂志，1997，17（1）：56.

[10] WU Q， WANG Y R， WU H. Optimization of cellulase hydrolysis extraction process of Folium ginseng by central composite design/response surface methodology[J]. Chin J Exp Tradit Med Form， 2006， 12（4）：5-8.

[11] SUN L， WANG Y R. Optimal extraction of effective constituents from Radix polygalae based on central composite design/response surface methodology[J]. Chin TraditPat Med， 2006，28（3）：328-331.

（责任编辑 龙小玲）

2.3.3 料液比 取牛大力药材粉末0.5 g，按照料液比分别为1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40添加溶剂并测定多糖提取率，结果见图6。由图6可知，多糖提取率随着料液比的降低而增加，1∶36时提取率最高，多糖基本提取完全，增加溶剂对多糖提取率影响较弱，因此选择料液比1∶36左右为宜。

2.4 星点试验结果

星点试验结果见表2。将所得数据用统计分析软件进行响应面分析。本次试验响应曲面待拟合的方程为：Y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x12+b5x22+b6x32+b7x1x2+b8x1x3+b9x2x3。应用STATISTICA 7.0软件包对按星点设计矩阵获得的试验数据进行多元回归与方差分析，得到优化后的二项式方程：

Y=498.819 8+142.820 6x1-99.847 3x12-72.185 7x22+49.557 49x1x2-41.547 1x1x3-40.603 7x2x3（r=0.904 3）。由此可见，有90.43%多糖含量归因于这3个因素的变化，只有9.57%不被此方程所解释。

根据拟合的二项式方程，绘制多糖随因素变化的响应面图，确定牛大力多糖的最佳工艺条件，结果见图7至图9。对二项式方程进行求导，可得：当提取条件为在89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，提取1次时，Y有预测的最大值554.6 mg/g。依据最佳提取工艺条件提取牛大力，设置3个重复进行验证试验，测得多糖含量为558.5 mg/g。

3 小结与讨论

响应面法是通过建立响应值与被考察因素的函数关系，从响应面上选择最佳的响应值，从而推出自变量取值范围即最佳试验条件的方法。因此，本试验必须采用单因素考察，方可确定合理的试验条件。近年国内较多利用星点设计试验所得的信息量大、直观的优点应用于优化中药提取工艺[10，11]。因此本研究采用星点设计的方法设计试验矩阵，对牛大力中多糖的提取工艺进行优化，将拟合得到的二项式方程进行求导，计算多糖含量最高时各个被考察因素的取值。最终确立牛大力的最佳提取条件为89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，在此条件下，多糖的实际含量为558.5 mg/g，与预测值554.6 mg/g较接近。

参考文献：

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（责任编辑 龙小玲）

2.3.3 料液比 取牛大力药材粉末0.5 g，按照料液比分别为1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32、1∶36、1∶40添加溶剂并测定多糖提取率，结果见图6。由图6可知，多糖提取率随着料液比的降低而增加，1∶36时提取率最高，多糖基本提取完全，增加溶剂对多糖提取率影响较弱，因此选择料液比1∶36左右为宜。

2.4 星点试验结果

星点试验结果见表2。将所得数据用统计分析软件进行响应面分析。本次试验响应曲面待拟合的方程为：Y=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b4x12+b5x22+b6x32+b7x1x2+b8x1x3+b9x2x3。应用STATISTICA 7.0软件包对按星点设计矩阵获得的试验数据进行多元回归与方差分析，得到优化后的二项式方程：

Y=498.819 8+142.820 6x1-99.847 3x12-72.185 7x22+49.557 49x1x2-41.547 1x1x3-40.603 7x2x3（r=0.904 3）。由此可见，有90.43%多糖含量归因于这3个因素的变化，只有9.57%不被此方程所解释。

根据拟合的二项式方程，绘制多糖随因素变化的响应面图，确定牛大力多糖的最佳工艺条件，结果见图7至图9。对二项式方程进行求导，可得：当提取条件为在89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，提取1次时，Y有预测的最大值554.6 mg/g。依据最佳提取工艺条件提取牛大力，设置3个重复进行验证试验，测得多糖含量为558.5 mg/g。

3 小结与讨论

响应面法是通过建立响应值与被考察因素的函数关系，从响应面上选择最佳的响应值，从而推出自变量取值范围即最佳试验条件的方法。因此，本试验必须采用单因素考察，方可确定合理的试验条件。近年国内较多利用星点设计试验所得的信息量大、直观的优点应用于优化中药提取工艺[10，11]。因此本研究采用星点设计的方法设计试验矩阵，对牛大力中多糖的提取工艺进行优化，将拟合得到的二项式方程进行求导，计算多糖含量最高时各个被考察因素的取值。最终确立牛大力的最佳提取条件为89.3 ℃，料液比1∶32，提取106 min，在此条件下，多糖的实际含量为558.5 mg/g，与预测值554.6 mg/g较接近。

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[11] SUN L， WANG Y R. Optimal extraction of effective constituents from Radix polygalae based on central composite design/response surface methodology[J]. Chin TraditPat Med， 2006，28（3）：328-331.

（责任编辑 龙小玲）