蜉蝣过敏原皮肤点刺试验、鼻黏膜激发试验与嗜碱性粒细胞激发实验的对比

龙　绮，李春林，蔡笃程，刘　硕，谢伟伟，孟　光

(海口市人民医院耳鼻咽喉头颈外科，海口 570208)

目前，过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)常用的诊断方法有血清特异性IgE检测(specific IgE，sIgE)、皮肤点刺试验(skin prick test，SPT)、血清吸入性过敏原过筛试验(Phadiatop)等[1]。本研究分析海南省重要过敏原蜉蝣临床皮肤点刺试验阳性率，选择SPT阳性患者进行鼻黏膜激发试验，并观察其阳性反应，另选择蜉蝣过敏原SPT试验阳性血液进行体外嗜碱性粒细胞激发实验，比较这3种方法结果是否相符。

对象和方法

对象

研究对象为2009年1月1日至2014年12月31日在海口市人民医院就诊的AR患者，所有患者均有不同程度的鼻痒、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞，部分有眼结膜充血、流泪等症状。AR诊断符合《过敏性鼻炎诊疗纲要2008》及我国AR指南的诊断标准[2-3]。行SPT前1周内未使用抗组胺类药物或糖皮质激素。

方法

AR患者进行蜉蝣过敏原SPT。选择30例蜉蝣过敏原SPT阳性(++)以上患者进行鼻黏膜激发试验；30例蜉蝣过敏原SPT阴性健康志愿者为对照。另选30例蜉蝣过敏原SPT阳性(++)以上患者进行嗜碱性粒细胞激发实验；30例SPT阴性健康志愿者血液为对照。所有研究对象均符合医学伦理学要求。

材料

皮肤试验过敏原由北京新华联协和药业有限公司生产。皮试液包括螨虫、霉菌、花粉、蜉蝣、过敏原溶媒阴性对照液和组胺阳性对照液等20种。组胺检测试剂盒由丹麦Feflab公司生产。

皮肤点刺试验

方法：SPT参照文献[4]方法进行。患者取坐位，手臂放松平放于桌面，用75%酒精消毒前臂掌侧皮肤两遍，再用蒸馏水将皮肤擦干净。待皮肤自然晾干后，将18种过敏原点刺液及阳性对照液和阴性对照液按照2 cm的间隔纵向排列两行滴在前臂，用点刺针的尖端垂直于皮肤，穿过点刺液，刺入皮内，停留大约1 s，点刺后20 min观察结果。

结果判断：以过敏原与组胺阳性对照液所致风团面积对比确定其反应级别。以组胺阳性对照直径为基准：(1)无风团、红晕反应小于组胺阳性对照的1/3为阴性(-)；(2)风团为组胺阳性对照1/2，红晕≤阳性对照者为(+)；(3)风团等于组胺阳性对照，红晕>阳性对照者为(++)；(4)风团和红晕均>阳性对照1倍者(+++)；(5)风团和红晕>组胺阳性对照2倍以上，并有伪足者为(++++)。本研究以(+++)和(++++)统计强阳性率。

鼻黏膜激发试验

参照文献[5]方法，取1 cm边长方形滤纸片，试验组滴入1∶100蜉蝣过敏原皮试液1滴浸湿滤纸片，对照组滴入注射用水1滴。受试者取坐位，试验前进行鼻部拍照，将滤纸片放入一侧鼻腔下鼻甲前部外侧面，鼻腔放入滤纸片后开始计时，一般观察5～15 min。阳性反应症状表现为鼻痒、喷嚏、黏液鼻涕增加，以及眼痒、流泪等；严重者可诱发哮喘发作；体检可发现鼻黏膜灰白水肿及分泌物增多。为预防哮喘发作，检查现场应准备必需的急救药物和设备。

嗜碱性粒细胞激发实验

血样准备：采用患者检测血清学IgE血样，肝素抗凝静脉血3 ml，离心(2 000 r/min)10 min，上清用于检测总IgE，剩下部分加入上清等量稀释液后混匀，取2 ml血样和1 ml稀释液分别加入包被有白细胞介素-3的试管中混匀，成为待检血样。阴性对照血样按同样方法准备。

过敏原提取液准备：取蜉蝣0.1 g，按1∶10比例加入试剂盒内稀释液，室温震荡提取30 min，离心取上清。按试剂盒操作说明将提取液按浓度梯度稀释待用。在已包被了玻璃纤维检测板的每孔中按稀释梯度加入25 μl过敏原提取液，之后按操作说明每孔加入待检血样和对照血样25 μl，置37℃温箱孵育60 min，取出洗板；在每孔中加150 μl的SDS wash buffer，37℃孵育30 min后取出洗板；最后在每孔中加75 μl荧光剂，室温下放置10 min，每孔中再加入75 μl终止液，检测系统校准后上机检测，通过测定荧光物质荧光值来测定组胺的浓度。

结果判定：结果依据被检过敏原激发患者嗜碱性粒细胞后产生组胺水平而判读为阳性和阴性。

统计学分析

统计蜉蝣过敏原SPT阳性率，嗜碱性粒细胞激发实验各组间阳性率采用SPSS17.0软件进行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

基线资料

共收集AR患者2 078例，年龄为5～65岁，平均(35.2±11.8)岁；男1 169例，女909例；发病时间为1～30年。进行鼻黏膜激发试验的30例蜉蝣过敏原SPT阳性(++)以上患者年龄15～55岁，男13例，女17例，发病时间2～30年。30例SPT阴性健康志愿者年龄15～50岁，男14例，女16例。进行嗜碱性粒细胞激发实验的30例蜉蝣过敏原SPT阳性(++)以上患者年龄12～50岁，男12例，女18例，发病时间5～20年；30例SPT阴性健康志愿者年龄10～45岁，男14例，女16例。

蜉蝣过敏原皮肤点刺试验结果

2078例AR患者蜉蝣过敏原SPT阴性者741例，阳性者1 337例，阳性率64.34%。其中(+)415例，(++)656例，(+++)227例，(++++)39例；(+++)和(++++)共266例，强阳性率为12.80%。

鼻黏膜激发试验结果

30例SPT阳性患者均在3～5 min内出现打喷嚏、流鼻涕、鼻塞，5例出现眼结膜充血、流泪等症状，未出现哮喘症状，阳性率为100.00%。30例阴性对照者在观察的15 min内均未出现阳性症状。

嗜碱性粒细胞激发实验结果

30例SPT阳性患者嗜碱性粒细胞激发实验阳性率为86.67%(26/30)，30例对照者嗜碱性粒细胞激发实验阳性率为6.25%(2/30)。2组阳性率比较，差异有统计学意义(χ2=10.3，P<0.05)。

讨　　论

AR主要由致敏物质进入鼻腔，使鼻腔黏膜与相应的IgE结合而引起的一种过敏反应性疾病，属IgE介导的Ⅰ型过敏反应，可引起多种并发症。近10年来AR患病率明显增加，大约影响到全球10%～25%的人群，尤其在工业发达的国家其患病率更高[6]。但在不同的地区，由于环境和物种的不同，引起AR的过敏原也存在较大差异。

蜉蝣目(Ephemeroptera)通称蜉蝣，具有古老而特殊的性状，是最原始的有翅昆虫，主要分布在热带至温带的广大地区。全世界已知有2 100余种，中国已知有100余种。常见的有蜉蝣科(Ephemeridae)和四节蜉蝣科(Baetidae)[4]。稚虫水生，蜉蝣是鱼类的重要饵料，成虫不取食，存活期1～7 d，死后尸体风干碎屑随风漂散于空气中，可致呼吸道过敏。海南省是我国位于亚热带与热带地区的省份，雨量丰沛、河流湖泊等水域宽广且水质优良，为蜉蝣的生长繁殖提供了广阔的空间，同时海南省也是渔业水产养殖大省，所以海南地区居民吸入或者接触到蜉蝣过敏原概率也较高[7]。

AR的诊断多以典型病史、鼻腔检查及过敏原的检测为主要依据，过敏原的检测中SPT由Lewis和Grant在1926年首先描述。因其操作简便、快速，且灵敏度、特异度以及重复性较好而被广为应用，并逐渐成为最重要的诊断方法，SPT在临床尤其是门诊AR的初步诊断中更具有价值和意义[8]。鼻黏膜激发试验是模拟自然发病条件，将可疑的过敏原或介质直接放置于鼻腔黏膜，引起一系列的病理生理学反应，从而确定特异性过敏原的试验。激发试验是诊断过敏性疾病的“金标准”之一，但过敏原体内激发试验对患者的风险性大，合作性差，不易被接受[9]。另外，因国内尚无统一的标准化过敏原，而国外产品进入我国品种单一，无地域性的特殊种类(如蜉蝣过敏原)，使体内试验受到严重限制。

体外血清学特异性IgE检测是令致敏物质与血清中的IgE结合，根据其浓度判断是否对致敏物质过敏，但是血清中其他原因产生的IgE(如寄生虫等)也可被计算在内而影响结果的准确性。嗜碱性粒细胞激发实验是用过敏原激发嗜碱性粒细胞，引起嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放组胺，对组胺进行检测，确定患者是否对该物质过敏。嗜碱性粒细胞在国外已成为一种广泛应用于临床的体外过敏原检测方法，主要用于诊断吸入性过敏原、食物过敏原、真菌、药物及洗涤剂过敏[10-12]。为此，本研究选择30例临床蜉蝣过敏原SPT阳性的患者血液(去除血清)进行嗜碱性粒细胞激发实验，结果与SPT、鼻黏膜激发试验结果比较，3种方法结果相符。特异性IgE检测受过敏原品种的限制，有些当地特殊的致敏物质无法检测，利用Histareader 501仪器及试剂盒，将其制备后放入试剂盒，检测组胺释放量，协助诊断，突破了皮肤点刺试验及血清学sIgE检测过敏原种类较少的限制，实现了对未经纯化或不能纯化的抗原或不能应用于临床的抗原进行检测的目标。

综上所述，蜉蝣过敏原的3种检测方法结果相符。嗜碱性粒细胞激发实验简便、易行、准确性高，在体内试验遇到瓶颈的时期，不失为一种检测地域性过敏原的好方法。

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