叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因与抽薹特性的表达分析

赵真真， 韩莹琰， 范双喜*， 李 婷， 王振雨， 刘秀萍

(1．北京农学院，北京昌平102206；2．北京市优质农产品产销服务站，北京朝阳 100101)

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因与抽薹特性的表达分析

赵真真1， 韩莹琰1， 范双喜1*， 李 婷1， 王振雨2， 刘秀萍2

(1．北京农学院，北京昌平102206；2．北京市优质农产品产销服务站，北京朝阳 100101)

[目的] 探讨叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因在抽薹前后的表达水平，分析Hsp70基因与叶用莴苣抽薹的相关性。[方法]采用实时荧光定量方法检测LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因在不同品种中的相对表达量，分析其差异性。[结果]LsHsp70-3701基因在热敏品种P-S11抽薹期的表达量显著高于抽薹前；在耐热品种G-S59抽薹初期的表达量与抽薹前无显著差异，但后期表达量显著降低。LsHsp70-1707基因在热敏品种P-S11抽薹初期表达量与抽薹前差异不显著，但其后表达水平显著高于抽薹前；在G-S59中抽薹期的最大表达量低于抽薹前的最大表达量，但两者差异不显著，而其他时间的相对表达量却显著低于抽薹前最高水平。[结论]LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因与叶用莴苣抽薹具有一定的相关性，叶用莴苣抽薹是差异基因表达的结果。

叶用莴苣；Hsp70；抽薹；表达分析

叶用莴苣喜冷凉气候，夏季高温易出现“先期抽薹”现象，导致产量和品质下降。培育耐热耐抽薹品种是解决“先期抽薹”问题的重要途径。抽薹是植物体由营养生长转为生殖生长的过渡期，受众多基因调控，目前已知的基因有180多个[1]，在多个基因的协同下植株完成花芽分化、花器官发生等过程[2-3]。植物抽薹过程中体内相关的组织会发生一系列的生理生化变化[4]，尤其是蛋白质组分，蛋白质是不同基因在不同时期表达的产物，在植物体一切生命活动过程中起重要作用，与植物的发育密切相关[5-6]，研究表明植物在花芽分化和抽薹前，叶片中积累了足够的可溶性蛋白等物质供植物抽薹时利用[7]。Hsp70是植物热激蛋白家族中重要的抗逆因子，其作为分子伴侣在蛋白质错误折叠[8]、维持细胞结构稳定、抵抗细胞凋亡[9]等方面发挥重要的作用。热激蛋白Hsp70基因与耐热性的关系在小麦[10]、拟南芥[11]、菠菜[12]等植物中已有报道，而抽薹天数在一定程度上能够较好地评价叶用莴苣种质资源的耐热性[13]，且Hsp70基因与叶用莴苣的耐热相关性已得到验证[14]。目前对抽薹机理研究主要集中在大白菜[15]、甜菜[16]等植物上，而关于抽薹性与Hsp70的相关性研究尚未见报道。笔者研究Hsp70基因在叶用莴苣抽薹前后的变化，推测其在抽薹过程中发挥的作用，为叶用抽薹机理的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料供试材料为2个具有典型抽薹特性的叶用莴苣品种，即热敏品种P-S11和耐热品种G-S59，且在正常栽培管理下P-S11品种的抽薹期比G-S59提早20～30 d。2014年8月在北京金六环农业园播种，待幼苗长至5～6叶大小时，将长势相近的幼苗移到人工气候培养箱中，生长条件为温度25 ℃，光照强度12 000 lx，光照时间12 h/d，20 ℃暗期12 h。取抽薹前后各6 d的叶片，液氮速冻，-80 ℃下保存备用。取样时间为8:30～9:00。

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-3701(登录号：KP055787)和LsHsp70-1707(登录号：KP258179)基因为笔者前期克隆的已知基因。

1.2 试验方法

1.2.1总RNA的提取及cDNA第一链的合成。使用RNApure Total RNA Kit RNApure 高纯总RNA快速提取试剂盒(艾德莱生物公司)提取叶用莴苣叶片总RNA。

取新鲜的植物叶片50～100 mg加1 ml Trizol研磨至匀浆状，转移至离心管中，静置5～10 min；加500 μl氯仿，涡旋振荡5 min，室温静置3 min；4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min；取上清至新的离心管，加700 μl氯仿，混匀，静置3 min；吸上清至新的离心管，加1/2倍无水乙醇，混匀；将全部溶液和混合物吸入吸附柱中，静置2 min，12 000 r/min离心3 min，弃废液；500 μl去蛋白液RE，12 000 r/min离心45 s，弃废液，重复一次；500 μl漂洗液RW，12 000 r/min离心45 s，弃废液，重复一次；将吸附柱放回空收集管中，12 000 r/min离心3 min，尽量除去漂洗液；吸附柱放入RNAase free 离心管中，在吸附膜中间部位加入30 μl RNAase free water，室温静置5 min，12 000 r/min离心2 min。

以提取的总RNA为模板，Oligo d(T)18为引物，M-MLV反转录酶、脱氧核糖核酸dNTP(10 mM)、RNase抑制剂(均购于TaKaRa公司)等作用合成cDNA第一链。

1.2.2实时荧光定量PCR。按照SYBR®PremixExTaqTM Ⅱ(购自TaKaRa)说明书，采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法对基因的表达性差异进行分析。以叶用莴苣18S ribosomal RNA(序列号：HM047292.1)为内参基因，实时荧光定量所用引物序列见表1。

将反转录所得的cDNA分别进行5倍梯度稀释(1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000)，并进行荧光定量反应，绘制标准曲线。反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s(40个循环)；最后65～95 ℃，每上升0.5 ℃保温30 s，检测其荧光值，绘制溶解曲线。内参基因反应程序与目标基因的反应程序相同，标准品cDNA和待测样品均设置3次重复。

表1 实时荧光定量所用引物序列

对2个品种抽薹前后的叶片组织进行实时荧光定量分析。以抽薹前第6天的叶片表达量为1，采用2-△△Ct法[17]计算并作图。采用SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 LsHsp70-3701基因在抽薹前后的表达分析热敏品种P-S11中，LsHsp70-3701基因在抽薹前表达水平保持稳定，而抽薹第1天表达量上升，相对表达量为3.68，抽薹第2天达到最大7.72，且抽薹前后基因的表达量差异极显著(P<0.01)，抽薹后表达量呈先上升后下降再上升再下降的趋势，但其表达水平与抽薹前的相对表达量有极显著差异(P<0.01)(图1A)。

耐热品种G-S59中，LsHsp70-3701基因整体表达水平稳定，抽薹第1天与抽薹前的表达量差异不显著，抽薹第2天相对表达量降低至0.42，与抽薹前的表达量差异极显著(P<0.01)，后呈先上升后下降趋势(图1B)。

2.2 LsHsp70-1707基因在抽薹前后的表达分析P-S11中，LsHsp70-1707基因在抽薹前表达水平较稳定，抽薹后第1天的表达量与抽薹前差异不显著，但第2天表达水平显著升高达到2.12，与抽薹前基因表达差异极显著(P<0.01)，之后表达水平缓慢下降，但与抽薹前差异并不显著(图2A)。

G-S59中，LsHsp70-1707基因在抽薹前有一个先上升后下降的趋势，抽薹前1 d基因表达水平较低，抽薹后第1天表达水平显著高于抽薹前1～4 d，但显著低于抽薹前第5天，之后表达量呈先下降后上升又下降的趋势，但均低于抽薹前最高水平，抽薹后第4天相对表达量达到最高，但与抽薹前第5天差异不显著(图2B)。

3 结论与讨论

刘磊等[18]在洋葱抽薹研究中发现，未抽薹植株游离氨基酸与可溶性蛋白质含量较高，推测洋葱发育过程中，蛋白质的代谢变化可能是决定其发育进程的内在原因；刘莎莎等[19]在菠菜抽薹特性研究中发现，抽薹期可溶性蛋白含量出现高峰，该研究中，LsHsp70-3701基因在P-S11中抽薹后的相对表达量显著高于抽薹前。在G-S59中，抽薹初期LsHsp70-3701的表达量与抽薹前无明显差异，且后期显著低于抽薹前，可能是由于抽薹早期较高的蛋白质含量对抽薹发生有利，抽薹后则可溶性蛋白含量降低，这与邱黛玉等[20]在当归抽薹性研究中的结果一致。

研究表明，当归在抽薹前期抽薹植株的可溶性蛋白含量比未抽薹植株高，而在抽薹临界点时抽薹植株的可溶性蛋白量却比未抽薹植株低[21]，这与LsHsp70-1707基因在P-S11中的表达情况一致，即在抽薹后第1天表达量低于抽薹前，而抽薹初期显著高于抽薹前。该研究中，LsHsp70-1707基因在G-S59中抽薹后的最高水平低于抽薹前最高水平，但两者差异不显著，抽薹后其他时间的相对表达量却显著低于抽薹前最高水平，这与当归植物可溶性蛋白的大量积累有利于抽薹开花，而在抽薹期因消耗大量营养物质而比未抽薹植株低的结果类似[21]。

甜菜抽薹过程中，蛋白质含量和氨基酸总量均增加，Glu、Gly、Ala、Met、Asp、Ser、Thr、Lys、Lue 等氨基酸组分抽薹前至抽薹时先升高，抽薹后又迅速下降，推测抽薹可能与这些氨基酸的变化有关，且甜菜抽薹可能是差异基因表达的结果[16]。LsHsp70-3701氨基酸含量较多的是Gly、Lys、Glu，LsHsp70-1707氨基酸含量较多的是Val、Ala、Gly，且这2个基因在不同品种叶用莴苣抽薹之后均有一个表达量升高后下降的过程，推测这2个基因与叶用莴苣抽薹具有一定的相关性，叶用莴苣抽薹可能也是差异基因表达的结果。

2个Hsp70基因在叶用莴苣不同品种抽薹前后的表达特性不同。在晚抽薹植株中抽薹后表达量的最高量低于抽薹前最高表达量，而在P-S11中2个Hsp70抽薹后的表达量高于抽薹前，这可能是由于晚抽薹品种能较好地适应抽薹过程，而早抽薹品种则需要大量的Hsp70蛋白质参与抽薹过程，为生殖生长做好充足的物质准备。通过检测LsHsp70-3701基因和LsHsp70-1707基因在不同抽薹特性的叶用莴苣品种中的表达水平，研究了Hsp70基因与叶用莴苣抽薹的相关性，为研究叶用莴苣抽薹机理提供了分子基础，为耐热耐抽薹特性的研究提供了新的思路

[1] FORNARA F,MONTAIGU A,COUPLAND G.SnapShot:Control of flowering inArbidopsis[J].Cell,2010,141:550-550.

[2] JUNG C,MULLER A E.Flowering time control and applications in plant breeding[J].Trends in Plant Science,2009,14(10):563-573.

[3] PU L,LIU M S,KIM S Y,et al.EMBRYONIC FLOWER 1 and ULTRAPETALA 1 act antagonistically on Arabidopsis development and stress response[J].Plant Physiology,2013,162(2):812-830.

[4] 陈敏,邱念伟,丁顺华,等.NaCl处理对盐地碱蓬整株及细胞水平的生长、溶质积累的影响[J].山东科学,2001,14(2):21-27.

[5] 刘磊,刘世琦.植物春化作用条件及机理研究进展[J].西北农业学报,2005,14(2):178-182.

[6] 尹钧,任江萍,潘登奎,等.小麦春化发育相关蛋白质同工酶的研究[J].麦类作物学报,2002,22(1):33-38.

[7] 李海燕,刘惕若,甄艳.辣椒品种对疫病的抗性研究—氨酸、丙二醛与可溶性糖在抗病中的作用[J].中国农学通报,2006,22(11):315 -317.

[8] BOORSTEIN W R,ZIEGELHOFFER T,CRAIG E A.Molecular evolution of the HSP70 multigene family[J].Journal of Molecular Evolution,1994,38(1):1-17.

[9] REROLEA L,JEGO G,GARRIDO C.Hsp70:Anti-apoptotic and tumorigenic protein[J].Methods Mol Biol,2011,787:205-230.

[10] DUAN Y H,GUO J,DING K,et al.Characterization of a wheat HSP70 gene and its expression in response to stripe rust infection and abiotic stresses[J].Molecular Biology Reporter,2011,38(1):301-307.

[11] LATIJNHOUWERS M,XU X M,MOLLER S G.Arabidopsisstromal 70-kDa heat shock proteins are essential for chloroplast development[J].Planta,2010,232(3):567-578.

[12] GUY C L,LI Q B.The organization and evolution of the spinach stress 70 molecular chaperone gene family[J].Plant Cell,1998,10:539-556.

[13] 陈青君,韩莹琰,谷建田,等.叶用莴苣种质资源的主要农艺性状鉴定与耐热性评价[J].中国蔬菜,2011(20):20-27.

[14] 李婷,韩莹琰,郝敬虹,等.叶用莴苣LsHsp70基因的克隆及表达分析[J].园艺学报,2013,40(6):1081-1089.

[15] 奥岩松,李式军.大白菜发育过程中可溶性蛋白质的变化[J].中国蔬菜,1997(2):19-21.

[16] 谷维,李彩凤,马凤鸣,等.甜菜当年抽薹过程中脂肪酸和蛋白质水解氨基酸组分的变化[J].核农学报2012,26(8):1209-1214.

[17] SCHMITTGEN T D,LIVAK K J.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method[J].Nature Protocols,2008,3:1101-1108.

[18] 刘磊,刘世琦,许莉,等.洋葱抽薹与未抽薹植株生理生化特性对比研究[J].中国农学通报,2006,22(1):149-152.

[19] 刘莎莎,魏佑营,王军伟,等.光周期对菠菜抽薹特性及可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响[J].山东农业科学,2009(10):29-31,34.

[20] 邱黛玉,蔺海明,方子森,等.种苗大小对当归成药期早期抽薹和生理变化的影响[J].草业学报,2010,19(6):100-105.

[21] 陆则权,张金文,任丽蓉,等.当归抽薹植株生理生化特征分析[J].中草药,2011,42(11):2326-2329.

Expression Analysis of Heat-shock-proteinLsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 Gene from Leaf Lettuce (LactucasativaL.) in Bolting

ZHAO Zhen-zhen,HAN Ying-yan,FAN Shuang-xi*et al

(Beijing University of Agriculture,Changping,Beijing 102206)

[Objective] The research preliminarily studied the expression of heat-shock-proteinLsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 and analyzed the correlation between Hsp70 gene and bolting of leaf lettuce.[Method] Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze theLsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 expression differences in different varieties ofLactucasativa.[Result] TheLsHsp70-3701 gene expression level in bolting were significantly higher than that before bolting in P-S11.The expression of the early bolting was no significant difference with the former boltingthe expression and significantly decreased in the late in G-S59.The difference ofLsHsp70-1707 gene expression inearly bolting and before bolting was not significant,but then expression levels were significantly higher than before bolting.The maximum expression of bolting lower than the maximum expression of before bolting and the difference was not significant in G-S59,but the expression of the other time was significantly lower than the highest level of before bolting.[Conclusion]LsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 have some relevance with bolting of leaf lettuce,and bolting is the result of differences in gene expression.

LactucasativaL.; Hsp70; Bolting; Expression analysis

国家自然科学基金项目“叶用莴苣高温抽薹相关蛋白的鉴定及其互作分析”(31372057)；国家自然科学基金项目“叶用莴苣高温胁迫响应因子LsHsp70的功能研究”(31401883)；北京市叶类蔬菜创新团队建设专项(blvt-02)；北京市农业科技项目“生菜耐热新品种繁育及安全生产技术试验示范”(20140134)；北京市科技成果转化提升计划项目“高产优质生菜产业化关键技术示范与成果转化”(PXM2015_014207_000012)。

赵真真(1990-)，女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：叶用莴苣热激蛋白。*通讯作者，教授，博士，从事叶用莴苣生理和分子方向研究。

2015-04-09

S 188

A

0517-6611(2015)14-027-03