紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC-6细胞的增殖作用

李艳云，张艳英，史秋梅，赵惠媛，王晓珊，卢会鹏 (河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北昌黎 066600)

紫锥菊多糖对LPS损伤后IEC-6细胞的增殖作用

李艳云，张艳英，史秋梅*，赵惠媛，王晓珊，卢会鹏 (河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北昌黎 066600)

[目的]为了研究紫锥菊多糖对LPS损伤后小肠上皮细胞株IEC-6细胞增殖的影响。[方法]以IEC-6细胞为研究对象，将LPS 10 μg/ml分别与EPS 50、100、200、500 μg/ml先后加入培养液，采用MTT方法检测细胞增殖率，观察紫锥菊多糖对该细胞增殖的影响。[结果]紫锥菊多糖100、500 μg/ml对LPS损伤后的IEC-6细胞分别在48、72 h具有促增殖作用，因此紫锥菊多糖对LPS损伤后的IEC-6细胞具有保护作用。[结论]紫锥菊多糖预处理能增强LPS损伤后IEC-6细胞的增殖活性，能降低LPS对IEC-6细胞的损伤而显现出对细胞的保护作用。

隐窝细胞；细胞增殖；脂多糖

紫锥菊(Echinaceapurpurea)是原产于美洲的一类菊科野生花卉，是世界闻名的“免疫”草药[1]。紫锥菊含有紫锥菊甙、多糖、菊苣酸等多种活性成分[2]，能刺激巨噬细胞的吞噬功能，使T淋巴细胞增殖，显著增强体液免疫功能，具有干扰素样作用，抑制病毒生长[3]。LPS是革兰氏阴性杆菌生长或死亡时裂解出来的细胞壁脂多糖成分，经肠道吸收进入血液循环后，导致体内细胞因子释放的“级联瀑布反应”引发多器官功能衰竭，甚至机体死亡[4-5]。小肠上皮隐窝细胞(IEC)在消化中不仅起吸收和交换营养的作用，而且是肠黏膜屏障的重要组成部分。它在宿主黏膜表面的天然及获得性免疫系统中起调节作用，是对抗肠道细菌、毒素的第一道防线[6-8]。而小肠上皮细胞的增殖是肠道黏膜病理性损伤后修复，从而重建上皮完整性和维护黏膜屏障的关键[9-10]。

选择大鼠小肠黏膜隐窝细胞株IEC-6为试验对象，通过LPS作用于IEC-6细胞上造成体外炎症性肠损伤模型，以观察紫锥菊对IEC-6细胞的增殖作用为目标进行活性追踪，从而明确紫锥菊对小肠黏膜修复的作用特点，阐明紫锥菊对肠黏膜修复作用的生物学机制，为药物治疗疾病提供现代药理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料供试紫锥菊多糖EPS购于南京泽朗医药科技有限公司，多糖类质量分数大于94%；IEC-6细胞株购自上海拜力生物科技有限公司；细菌内毒素(LPS：E.ColiO55：B5，货号L6529，Sigma产品)购于上海前尘生物科技有限公司；细胞培养液DMEM，胎牛血清，胰岛素，噻唑蓝(MTT)：Sigma 公司产品；培养瓶、培养板购自美国Corning 公司。

完全培养液(cDMEM)由浓度90%DMEM、浓度10%进口胎牛血清、0.01 mg/ml胰岛素组成；MTT溶液的制备方法为：取MTT 250 mg，37 ℃水浴中溶于50 ml 0.01 mmol/L pH 7.4的PBS中，浓度为5 mg/ml，过滤除菌分装，冻存；LPS溶液的制备方法为：取LPS适量，分别用PBS稀释至5、10、20 μg/ml，冻存；紫锥菊多糖溶液用蒸馏水稀释至50、100、200、500 μg/ml，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1细胞的培养。IEC-6细胞株用浓度10%胎牛血清的DMEM培养基，配以0.01 mg/ml胰岛素，在CO2培养箱(37 ℃，5%CO2)中常规培养。

1.2.2细胞分组。将培养的细胞随机分为六大组：A组空白对照组，以DMEM培养液为空白对照；B组单纯LPS组，LPS浓度为10 μg/ml；C组单纯EPS组，分为四亚组，即①EPS 50 μg/ml，②EPS 100 μg/ml，③EPS 200 μg/ml，④EPS 500 μg/ml；D组LPS与不同浓度EPS组，分为四亚组，即①LPS 10 μg/ml+EPS 50 μg/ml组，②LPS 10 μg/ml+EPS 100 μg/ml组，③ LPS 10 μg/ml+EPS 200 μg/ml组，④LPS 10 μg/ml+EPS 500 μg/ml组；E组EPS预处理与不同浓度LPS组，分为三亚组，即①EPS 500 μg/ml+LPS 5 μg/ml组，②EPS 500 μg/ml+LPS 10 μg/ml组，③ EPS 500 μg/ml+LPS 20 μg/ml组。每组试验均重复3次。

1.2.3EPS对正常IEC-6细胞增殖的影响。取对数生长期细胞；用浓度0.25%胰酶加上浓度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min离心10 min，用DMEM悬浮细胞；用细胞记数板准确记数，以每孔1×104/200 μl密度接种于96孔微量培养板中，培养24 h，保证每孔细胞铺满孔底；24 h后取出培养物，加入不同浓度的EPS 100 μl，使其终浓度分别为50、100、200、500 μg/ml，空白对照组加入等量的DMEM；在CO2培养箱中继续培育24、48、72 h；培养时间结束后，从CO2培养箱中取出，加入MTT 20 μl，培养4 h；1 500 r/min离心5 min，弃上清；加入DMSO 150 μl，作用5 min，微振荡，490 nm波长上测定每孔OD值；最后，计算细胞增殖率。

细胞增殖率=[1-(对照组OD-试验组OD)/对照组OD]×100%

1.2.4EPS对LPS作用下IEC-6细胞增殖的影响。取对数生长期细胞；用浓度0.25%胰酶加上浓度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min离心10 min，用DMEM悬浮细胞；用细胞记数板准确记数，以每孔1×104/200 μl的密度接种于96孔微量培养板中，培养24 h，保证每孔细胞铺满孔底；24 h后取出培养物，加入10 μg/ml浓度的LPS 100 μl，继续在37 ℃，5%CO2培养箱中培育1 h；取出后，再加入不同浓度的EPS 100 μl，使其最终浓度分别为50、100、200、500 μg/ml，对照组加入等量的DMEM；在CO2培养箱中分别培育24、48、72 h；培养时间结束后，从CO2培养箱中取出，MTT处理方法步骤同“1.2.3”；最后，计算细胞增殖率。

1.2.5EPS预处理对LPS作用下IEC-6细胞增殖的影响。取对数生长期细胞；用浓度0.25%胰酶和浓度0.02%EDTA消化4 min，1 000 r/min离心10 min，用DMEM悬浮细胞；用细胞记数板准确记数，以每孔1×104/200 μl密度接种于96孔微量培养板中，培养24 h，保证每孔细胞铺满孔底；24 h后取出培养物，加入500 μg/ml浓度的EPS100 μl预处理24 h；然后，给予LPS，使其终浓度分别为5、10、20 μg/ml，对照组加入等量的DMEM；在CO2培养箱中继续分别培育1 h；培养时间结束后，从CO2培养箱中取出，MTT处理方法同步骤“1.2.3”；最后，计算细胞增殖率。

1.3 统计学分析所有数据以均值±标准差表示。用SPSS17.0统计软件包进行单因素方差分析，以P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 正常及LPS损伤后小肠上皮细胞形态观察正常小肠上皮细胞株由均匀的上皮样细胞群体组成，呈铺路石镶嵌排列，互不重叠，为典型单层，细胞为不规则多角形，边界清楚，细胞核较大，呈现卵圆形，细胞间相互连接，呈现旺盛的增殖性(图1)。LPS损伤的小肠上皮细胞呈现细胞边界模糊，细胞由多角形转变为圆形，细胞胞浆内出现大量颗粒样物质，部分细胞膜破裂，细胞形态不完整(图2～4)。

2.2 EPS对正常培养的IEC-6细胞增殖作用的影响EPS在不同时间段对正常培养的IEC-6细胞增殖作用不同。不同浓度的EPS对细胞的增殖作用有统计学意义上的差异。由表1、图5可知，EPS对IEC-6细胞呈现剂量依赖性促增殖作用，但是随着处理时间的延长，不同浓度的促增殖效果也不尽相同，表现为第24小时200 μg/ml EPS有显著促增殖作用，而在第72小时EPS浓度为100 μg/ml时才表现出显著的促增殖效应。总体来讲，200 μg/ml浓度的EPS效果最佳，见表1、表2、图5。

2.3 EPS对LPS损伤后IEC-6细胞增殖作用的影响IEC-6细胞受LPS(10 μg/ml)作用1 h后，在培养体系中加入不同浓度的EPS，观察EPS对LPS损伤后IEC-6细胞是否仍有促增殖作用。由表2、图6可知，受LPS作用的细胞，EPS浓度为50 μg/ml时作用24 h的效果最好，EPS浓度为100 μg/ml时作用48 h效果最好，而EPS浓度为500 μg/ml时作用在72 h达到最佳效果。

表1 EPS对正常培养的IEC-6细胞增殖活性的影响

表2 EPS对LPS作用下的IEC-6细胞增殖活性的影响

2.4 EPS预处理对LPS损伤的IEC-6细胞增殖作用的影响将培养的IEC-6细胞用500 μg/ml EPS预处理24 h，然后加不同浓度的LPS(分别为5、10、20 μg/ml)，观察1 h，测定细胞增殖活性。由表3、图7可知，EPS预处理后对LPS有显著的促增殖作用。当受到5 μg/ml LPS作用时，与对照组相比，EPS预处理组没有显著的促增殖作用。但是，当受到10、20 μg/ml LPS作用时，与对照组相比，EPS预处理组有0.05水平显著的促增殖作用。

表3 EPS预处理后LPS作用下的IEC-6细胞的增殖活性

3 结论与讨论

小肠上皮隐窝细胞是肠道内重要的功能细胞，在免疫系统中起着重要的调节作用，并与肠道的内、外分泌功能有密切关系。肠道黏膜损伤后的修复主要依靠隐窝细胞的不断增殖、分化，从而重建肠屏障功能。因此，研究肠上皮隐窝细胞的增殖对于修复肠黏膜损伤具有重要意义。研究表明，紫锥菊多糖对正常IEC-6细胞具有促进细胞增殖的作用。研究进一步显示，对于受LPS损伤的小肠上皮细胞，当向培养体系中加入不同浓度的紫锥菊多糖时，在不同时间段、不同浓度均有促增殖作用。试验还显示，紫锥菊多糖预处理能增强LPS损伤后IEC-6细胞的增殖活性，能降低LPS对IEC-6细胞的损伤而显现出对细胞的保护作用。这一作用在LPS 5 μg/ml小剂量时不明显，而在剂量为10、20 μg/ml时有明显的作用。这提示紫锥菊多糖的治疗效果也取决于LPS对IEC-6细胞的损伤程度。小剂量LPS对肠道上皮的损伤较小，影响细胞的增殖功能不明显，随着LPS剂量的增大，对IEC-6细胞的损伤也增强，此时紫锥菊多糖的促增殖效果明显显现。试验证明，紫锥菊多糖有促进肠黏膜上皮损伤修复的潜能。这从肠黏膜理化损伤修复角度说明预防性应用紫锥菊多糖在治疗内毒素血症引起的胃肠功能障碍中对减轻肠道损伤具有一定的应用价值

[1] 肖培根.国际流行的免疫调节剂——紫锥菊及其制剂[J].中草药，1996，27(1)：46-48.

[2] 吴华，方和沐.免疫增强剂——紫锥菊的研究进展[J].青海畜牧兽医杂志，2010，40(3)：43-46.

[3] 窦德明，崔树玉，曹永智，等.引种紫锥菊有效成分菊苣酸含量研究[J].中草药，2001，32(11)：987-988.

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The Multiplication Effect ofEchinaceapurpureaPolysaccharide on IEC-6 Cell after LPS Injury

LI Yan-yun, ZHANG Yan-ying, SHI Qiu-mei*et al

(Hebei Province Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine, Hebei Normal University of Science and Technology, Changli, Hebei 066600)

[Objective] To study effects ofEchinaceapurpureapolysaccharide on intestinal epithelial cell line IEC-6 cells multiplication after LPS damaged. [Method] To observe the effects ofEchinaceapurpureapolysaccharide on the cell multiplication, using IEC-6 cell as the research object, adding LPS 10 μg/ml into medium with EPS 50, 100, 200, 500 μg/ml, the rate of cell multiplication was detected by MTT method. [Result] The concentration ofEchinaceapurpureapolysaccharide at 100 and 500 μg/ml could promote proliferation on IEC-6 cells after LPS damaged in 48 and 72 h. So,Echinaceapurpureapolysaccharide had a protective effect on IEC-6 cells that LPS injured. [Conclusion]Echinaceapurpureapolysaccharide pretreatment can enhance the proliferation activity of IEC-6 cells and reduce the damage of IEC-6 cells after LPS injured, and show protective effect on cells.

Crypt cell; Cell multiplication; Lipopolysaccharide

国家自然基金项目(31472230)；河北省自然基金项目(C2014407068)；河北省科技支撑计划(14966610D、12220408D)；石家庄市科技支撑计划(131200063A)；河北省教育厅百名优秀创新人才支持计划(Ⅱ)、ZH2011244、Q2012037。

李艳云(1986- )，女，河南上蔡人，硕士研究生，研究方向：动物病原微生物与动物传染病。*通讯作者，教授，从事动物传染病学方面的研究。

2015-03-27

S 852.6

A

0517-6611(2015)14-019-03