Mg2+对兔脑继发性脑损伤中细胞凋亡影响的实验研究

张琦辉+董世节+黎志迪+李华晓+王士强

[摘要] 目的 探讨Mg2+对兔脑继发性脑损伤中细胞凋亡影响的实验情况。 方法 选择新西兰大白兔50只，随机分为实验组、对照组和假手术组，实验组及对照组各20只，假手术组10只；实验组及对照组动物在脑外伤后早期静脉使用硫酸镁后，通过对挫伤灶周围脑组织的病理学检查、透视电镜检查及细胞调亡的检测，分析镁离子对脑继发性损害中细胞调亡的影响。 结果 对照组脑损伤6 h后，组织病理学显示损伤病灶出血、组织间隙增宽、周围细胞水肿，脑损伤后48 h最为显著，损伤病灶内出现胞膜结构完整、细胞核固缩深染的神经细胞，即神经细胞凋亡，凋亡细胞相对密集；实验组神经细胞变性坏死较少、脑水肿较轻，两侧病变差异不显著；正常脑组织内TUNEL阳性细胞表达较少，损伤6 h的标本出现TUNEL散在少量阳性细胞，两组标本中的TUNEL阳性细胞数量随着损伤时间的延长而逐渐增加，峰期为24 h，实验组各时段的TUNEL阳性细胞显著低于同时段的对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 镁离子可降低兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

[关键词] 实验研究；细胞凋亡；继发性脑损伤；镁离子

[中图分类号] R743.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）35-0005-03

脑外伤是一种引起外伤性死亡和残疾的全球主要公共卫生问题之一，在深圳宝安区，脑外伤的致死和致残率在所有外伤性疾病中所占比例一直居高不下[1]。由于原发性脑损伤后常常伴有继发性脑损害，此类患者即使存活，但意识、语言、肢体的感觉及运动功能往往留下不同程度的障碍，甚至成为植物人，给个人和社会都带来了一系列不利的影响，加重了社会负担[2]。本课题通过动物实验验证Mg2+是否通过抑制脑外伤后继发性脑损害中细胞凋亡的发生，从而保护病灶周围神经细胞免受进一步损害，分析其可能的作用机制并指导临床应用，效果满意，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物

健康成年新西兰大白兔50只，体重500～750 g，雄兔与雌兔各25只，由本实验动物中心代为饲养。

1.2实验仪器

日本SANYO超低温冰箱、LEICA CM1900低温恒冷冰冻切片机、武汉千屏影像技术有限责任公司生产的HPIAS-1000PD高清晰度彩色病理图文分析系统、美国Labconco freeze dry system、上海嘉鹏科技有限公司生产的TGL-16G-A型高速冷冻离心机、德国ZEISS正置全自动荧光显微镜、北京中仪光科科技发展有限公司生产的OLYMPUS生物显微镜BX53、北京中西远大科技有限公司生产的SA2-WDP-350型电热恒温箱。

1.3药物与试剂

德国Bocshringcr Mannhcim 公司提供TUNEL染色试剂盒；甘露醇注射液（国药准字H36020770；江西制药有限责任公司）；硫酸镁注射液（国药准字H20033861；河北天成药业股份有限公司）。

1.4 实验方法

（1）动物分组及模型制作：新西兰大白兔50只，随机分成实验组、对照组和假手术组，实验组及对照组各20只，假手术组10只。用1%戊巴比妥钠50 mg/Kg腹腔麻醉后，在兔右侧颅顶部用牙科钻开一直径为1.5 cm的骨窗，注意保持硬脑膜完整，按文献采用自由落体法造成右顶叶较为一致的脑挫裂伤，冲击力为50 g×15 cm；假手术组只开放骨窗，不给予打击。对照组于术后常规使用20%甘露醇静滴，实验组除使用20%甘露醇外，于术后30 min开始静注硫酸镁0.5 g（4 mmol），然后将2 g（16 mmol）硫酸镁稀释至250 mL于24 h内缓慢静滴。连用3 d。（2）取材与处理：根据分组方法分别在伤后12 h、24 h和48 h处死。采用同上麻醉方法麻醉后，断头取脑，切取伤灶及其周边脑组织，分别做病理学观察、透视电镜观察及TUNEL细胞凋亡检测。

1.5病理学判断及评估标准

（1）末端脱氧核糖核酸转移酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（TDT Mcdiatcd Biotin dUTP Nick End Labcling，TUNEL）结果评估：400高倍光学显微镜下，每张切片任选5个视野，计算阳性细胞的平均数；（2）石蜡切片的苏木素-伊红（Hcmatoxylin and cosin HE）染色结果评估：正常细胞核胞浆呈粉红色或红色，正常细胞核呈蓝色[3]。

1.6统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件分析所有数据，计量资料数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，不同时点计量资料比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

对照组脑损伤后6 h，组织病理学显示损伤病灶出现出血，组织间隙增宽、周围细胞水肿，脑损伤后48 h最为显著，损伤病灶内出现胞膜结构完整、细胞核固缩深染的神经细胞，即神经细胞凋亡，实验组神经细胞变性坏死较少，脑水肿较轻，两侧病变差异不显著。

2.2 TUNEL方法检测结果

正常脑组织内TUNEL阳性细胞表达较少，损伤6 h的标本出现TUNEL散在少量阳性细胞，两组标本中的TUNEL阳性细胞数量随着损伤时间的延长而逐渐增加，峰期为24 h，实验组各时段的TUNEL阳性细胞显著低于同时段的对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

3 讨论

急性颅脑损伤疾病是指头颅遭受剧烈暴力导致的损伤，可由火器、工伤、交通意外引发，临床较为常见。急性颅脑损伤临床多伴有毛细血管通透性增强、颅内压升高、高热、脑水肿、脑疝等并发情况[4]。临床分为开发性和闭合性脑外伤，脑损伤常引起不同程度的永久性功能障碍。主要取决于损害是在脑组织的某个特定区域（局灶性）还是广泛性的损害（弥散性）。不同区域的脑损害可引起不同的症状，这些特殊的局灶性症状有助于医生确定损伤部位。局灶性症状包括运动、感觉、言语、视觉、听觉异常等症状。而弥散性脑损害常影响记忆、睡眠或导致意识模糊和昏迷。该病临床主要表现为意识障碍、脑膨出、血肿、挫裂伤、颅内感染等症状，主要通过颅脑CT、MRI诊断，该病主要以“优先抢救生命，后处理局部损伤”为救治原则[5]。目前对于Mg2+对兔脑继发性脑损伤细胞凋亡的影响已成为国内外医学实验研究者的重要研究课题[6]。

本研究探析Mg2+对兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡的影响，脑损伤后的神经功能障碍与伤后神经细胞凋亡密切相关。细胞的死亡是由于细胞器（如线粒体）不可逆受损，细胞膜通透性增高，细胞质内容物漏出进入细胞外基质中。而凋亡是由基因调控介导的细胞程序性死亡，在这个过程中细胞膜通透性没有改变，细胞器完好保存。在最后阶段，细胞碎片萎缩卷曲到原生质膜上形成凋亡小体，然后被周围健康细胞吞噬。实验证明，Mg2+对缺血缺氧性脑损害引起的神经元凋亡有一定的预防作用。镁离子的神经功能保护机制为对N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体起到非竞争性拮抗作用，使受体活性得到抑制，减少氧自由基，降低钙离子内流。脑损伤后自由基介导的脂质过氧化反应增强是导致脑细胞水肿、变性坏死的重要原因[7]。低Mg2+时，依赖Mg2+的花生四烯酸合成酶的活性降低，在磷脂酶A的作用下，引发花生四烯酸代谢瀑布，产生大量自由基。另外，Mg2+缺乏可导致细胞内Ca2+增加，致黄嘌呤氧化酶大量产生，激活ATP酶使ATP分解，ATP分解合成的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下产生各种自由基反应，导致细胞膜的结构和功能破坏[8]。Mg2+能通过多种机制阻断Ca2+内流，抑制自由基的形成，减轻脂质过氧化反应，防止细胞膜损害，减轻脑水肿。有研究发现，暴露在低镁环境中的犬血管平滑肌3 h后MDA浓度就上升，18～24 h后升高到正常水平的3～12倍。且Mg2+浓度越低，MDA水平就越高。给实验性脑损伤模型兔脑Mg2+治疗能降低脑组织MDA的含量。脑组织缺血缺氧可导致急性能量代谢障碍，抑制膜Na+-H+-ATP酶的活性，导致神经元去极化，激活神经元T型和 N型Ca2+通道，大量Ca2+内流，导致细胞破坏。另外，细胞外液中Mg2+可电压门控NMDA受体。细胞超极化时，NMDA受体通道完全被阻滞。细胞去极化时，Mg2+的阻滞作用逐渐减少并消失。研究发现，经Mg2+治疗的大鼠脑细胞去极化时间及脑蛛网膜下腔出血急性期损伤面积明显小于安慰剂组[9]。推测Mg2+的神经保护作用可能在于减少了脑细胞缺血性去极化时间。本研究探析镁离子对兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡的影响，结果显示对照组脑损伤后6 h，组织病理学显示损伤病灶出血、组织间隙增宽、周围细胞水肿，脑损伤后48 h最为显著，损伤病灶内出现胞膜结构完整、细胞核固缩深染的神经细胞，即神经细胞凋亡，凋亡细胞相对较为密集；实验组神经细胞变性坏死较少、脑水肿较轻，两侧病变差异不显著；正常脑组织内TUNEL阳性细胞表达较少，损伤6 h的标本出现TUNEL散在少量阳性细胞，两组标本中的TUNEL阳性细胞数量随着损伤时间的延长而逐渐增加，峰期为24 h，实验组各时段的TUNEL阳性细胞显著低于同时段的对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与Pattee GL等[10]的研究结果大体一致，说明镁离子可降低继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

综上所述，镁离子可降低兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

[参考文献]

[1] 夏东剑. 硫酸镁对创伤性脑损伤大鼠血清NSE含量的影响[J]. 中国老年保健医学，2014，11（3）：134-135.

[2] 王利利，涂彧，周菊英，等. 硫酸镁对大鼠急性放射性脑损伤后脂质过氧化的抑制作用[J]. 国际放射医学核医学杂志，2007，31（1）：179-182.

[3] 郑慧芬，涂彧. 硫酸镁对急性放射性脑损伤后神经细胞凋亡的影响[J]. 现代中西医结合杂志，2009，18（4）：217-220.

[4] 李玉，潘彦成，朱贤立. 硫酸镁对弥漫性脑损伤脑组织的保护作用及机制[J]. 中华实验外科杂志，2009，26（8）：144-145.

[5] 史建国，董亚楠，高军，等. 急性颅脑损伤患者血清Mg2+、IL-6、IL-8的动态监测研究[J]. 医学信息（上旬刊），2010， 23（10）：143-145.

[6] 刘红峰，范秀芳，郝素媛，等. 孕母产前应用硫酸镁对低出生体重儿血镁水平和新生儿期脑损伤的影响[J]. 中国优生与遗传杂志，2005，13（12）：156-157.

[7] 秦峰，高超，张浩，等. 硫酸镁对重型颅脑损伤患者神经功能的影响[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2009，3（6）：117-120.

[8] 杨南瑜，沈伟峰，许燕球. 血清镁与颅脑损伤严重程度及预后的相关性[J]. 中国医药科技，2012，47（14）：144-145.

[9] Zhang XS，Zhang X，Wu Q，et al. Astaxanthin alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats：possible involvement of akt/bad signaling[J]. Mar Drugs，2014，12（8）：4291-4293.

[10] Pattee GL，Wymer JP，Lomen-Hoerth C，et al. An open-label multicenter study to assess the safety of dextromethorphan/quinidine in patients with pseudobulbar affect associated with a range of underlying neurological conditions[J]. Curr Med Res Opin，2014，6（28）：1-11.

（收稿日期：2014-08-15）

本研究探析Mg2+对兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡的影响，脑损伤后的神经功能障碍与伤后神经细胞凋亡密切相关。细胞的死亡是由于细胞器（如线粒体）不可逆受损，细胞膜通透性增高，细胞质内容物漏出进入细胞外基质中。而凋亡是由基因调控介导的细胞程序性死亡，在这个过程中细胞膜通透性没有改变，细胞器完好保存。在最后阶段，细胞碎片萎缩卷曲到原生质膜上形成凋亡小体，然后被周围健康细胞吞噬。实验证明，Mg2+对缺血缺氧性脑损害引起的神经元凋亡有一定的预防作用。镁离子的神经功能保护机制为对N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体起到非竞争性拮抗作用，使受体活性得到抑制，减少氧自由基，降低钙离子内流。脑损伤后自由基介导的脂质过氧化反应增强是导致脑细胞水肿、变性坏死的重要原因[7]。低Mg2+时，依赖Mg2+的花生四烯酸合成酶的活性降低，在磷脂酶A的作用下，引发花生四烯酸代谢瀑布，产生大量自由基。另外，Mg2+缺乏可导致细胞内Ca2+增加，致黄嘌呤氧化酶大量产生，激活ATP酶使ATP分解，ATP分解合成的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下产生各种自由基反应，导致细胞膜的结构和功能破坏[8]。Mg2+能通过多种机制阻断Ca2+内流，抑制自由基的形成，减轻脂质过氧化反应，防止细胞膜损害，减轻脑水肿。有研究发现，暴露在低镁环境中的犬血管平滑肌3 h后MDA浓度就上升，18～24 h后升高到正常水平的3～12倍。且Mg2+浓度越低，MDA水平就越高。给实验性脑损伤模型兔脑Mg2+治疗能降低脑组织MDA的含量。脑组织缺血缺氧可导致急性能量代谢障碍，抑制膜Na+-H+-ATP酶的活性，导致神经元去极化，激活神经元T型和 N型Ca2+通道，大量Ca2+内流，导致细胞破坏。另外，细胞外液中Mg2+可电压门控NMDA受体。细胞超极化时，NMDA受体通道完全被阻滞。细胞去极化时，Mg2+的阻滞作用逐渐减少并消失。研究发现，经Mg2+治疗的大鼠脑细胞去极化时间及脑蛛网膜下腔出血急性期损伤面积明显小于安慰剂组[9]。推测Mg2+的神经保护作用可能在于减少了脑细胞缺血性去极化时间。本研究探析镁离子对兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡的影响，结果显示对照组脑损伤后6 h，组织病理学显示损伤病灶出血、组织间隙增宽、周围细胞水肿，脑损伤后48 h最为显著，损伤病灶内出现胞膜结构完整、细胞核固缩深染的神经细胞，即神经细胞凋亡，凋亡细胞相对较为密集；实验组神经细胞变性坏死较少、脑水肿较轻，两侧病变差异不显著；正常脑组织内TUNEL阳性细胞表达较少，损伤6 h的标本出现TUNEL散在少量阳性细胞，两组标本中的TUNEL阳性细胞数量随着损伤时间的延长而逐渐增加，峰期为24 h，实验组各时段的TUNEL阳性细胞显著低于同时段的对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与Pattee GL等[10]的研究结果大体一致，说明镁离子可降低继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

综上所述，镁离子可降低兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

[参考文献]

[1] 夏东剑. 硫酸镁对创伤性脑损伤大鼠血清NSE含量的影响[J]. 中国老年保健医学，2014，11（3）：134-135.

[2] 王利利，涂彧，周菊英，等. 硫酸镁对大鼠急性放射性脑损伤后脂质过氧化的抑制作用[J]. 国际放射医学核医学杂志，2007，31（1）：179-182.

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[4] 李玉，潘彦成，朱贤立. 硫酸镁对弥漫性脑损伤脑组织的保护作用及机制[J]. 中华实验外科杂志，2009，26（8）：144-145.

[5] 史建国，董亚楠，高军，等. 急性颅脑损伤患者血清Mg2+、IL-6、IL-8的动态监测研究[J]. 医学信息（上旬刊），2010， 23（10）：143-145.

[6] 刘红峰，范秀芳，郝素媛，等. 孕母产前应用硫酸镁对低出生体重儿血镁水平和新生儿期脑损伤的影响[J]. 中国优生与遗传杂志，2005，13（12）：156-157.

[7] 秦峰，高超，张浩，等. 硫酸镁对重型颅脑损伤患者神经功能的影响[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2009，3（6）：117-120.

[8] 杨南瑜，沈伟峰，许燕球. 血清镁与颅脑损伤严重程度及预后的相关性[J]. 中国医药科技，2012，47（14）：144-145.

[9] Zhang XS，Zhang X，Wu Q，et al. Astaxanthin alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats：possible involvement of akt/bad signaling[J]. Mar Drugs，2014，12（8）：4291-4293.

[10] Pattee GL，Wymer JP，Lomen-Hoerth C，et al. An open-label multicenter study to assess the safety of dextromethorphan/quinidine in patients with pseudobulbar affect associated with a range of underlying neurological conditions[J]. Curr Med Res Opin，2014，6（28）：1-11.

（收稿日期：2014-08-15）

本研究探析Mg2+对兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡的影响，脑损伤后的神经功能障碍与伤后神经细胞凋亡密切相关。细胞的死亡是由于细胞器（如线粒体）不可逆受损，细胞膜通透性增高，细胞质内容物漏出进入细胞外基质中。而凋亡是由基因调控介导的细胞程序性死亡，在这个过程中细胞膜通透性没有改变，细胞器完好保存。在最后阶段，细胞碎片萎缩卷曲到原生质膜上形成凋亡小体，然后被周围健康细胞吞噬。实验证明，Mg2+对缺血缺氧性脑损害引起的神经元凋亡有一定的预防作用。镁离子的神经功能保护机制为对N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体起到非竞争性拮抗作用，使受体活性得到抑制，减少氧自由基，降低钙离子内流。脑损伤后自由基介导的脂质过氧化反应增强是导致脑细胞水肿、变性坏死的重要原因[7]。低Mg2+时，依赖Mg2+的花生四烯酸合成酶的活性降低，在磷脂酶A的作用下，引发花生四烯酸代谢瀑布，产生大量自由基。另外，Mg2+缺乏可导致细胞内Ca2+增加，致黄嘌呤氧化酶大量产生，激活ATP酶使ATP分解，ATP分解合成的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下产生各种自由基反应，导致细胞膜的结构和功能破坏[8]。Mg2+能通过多种机制阻断Ca2+内流，抑制自由基的形成，减轻脂质过氧化反应，防止细胞膜损害，减轻脑水肿。有研究发现，暴露在低镁环境中的犬血管平滑肌3 h后MDA浓度就上升，18～24 h后升高到正常水平的3～12倍。且Mg2+浓度越低，MDA水平就越高。给实验性脑损伤模型兔脑Mg2+治疗能降低脑组织MDA的含量。脑组织缺血缺氧可导致急性能量代谢障碍，抑制膜Na+-H+-ATP酶的活性，导致神经元去极化，激活神经元T型和 N型Ca2+通道，大量Ca2+内流，导致细胞破坏。另外，细胞外液中Mg2+可电压门控NMDA受体。细胞超极化时，NMDA受体通道完全被阻滞。细胞去极化时，Mg2+的阻滞作用逐渐减少并消失。研究发现，经Mg2+治疗的大鼠脑细胞去极化时间及脑蛛网膜下腔出血急性期损伤面积明显小于安慰剂组[9]。推测Mg2+的神经保护作用可能在于减少了脑细胞缺血性去极化时间。本研究探析镁离子对兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡的影响，结果显示对照组脑损伤后6 h，组织病理学显示损伤病灶出血、组织间隙增宽、周围细胞水肿，脑损伤后48 h最为显著，损伤病灶内出现胞膜结构完整、细胞核固缩深染的神经细胞，即神经细胞凋亡，凋亡细胞相对较为密集；实验组神经细胞变性坏死较少、脑水肿较轻，两侧病变差异不显著；正常脑组织内TUNEL阳性细胞表达较少，损伤6 h的标本出现TUNEL散在少量阳性细胞，两组标本中的TUNEL阳性细胞数量随着损伤时间的延长而逐渐增加，峰期为24 h，实验组各时段的TUNEL阳性细胞显著低于同时段的对照组，差异有统计学意义（P<0.05），与Pattee GL等[10]的研究结果大体一致，说明镁离子可降低继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

综上所述，镁离子可降低兔脑继发性脑损伤中神经细胞凋亡数量，对脑损伤神经细胞起到保护作用。

[参考文献]

[1] 夏东剑. 硫酸镁对创伤性脑损伤大鼠血清NSE含量的影响[J]. 中国老年保健医学，2014，11（3）：134-135.

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[3] 郑慧芬，涂彧. 硫酸镁对急性放射性脑损伤后神经细胞凋亡的影响[J]. 现代中西医结合杂志，2009，18（4）：217-220.

[4] 李玉，潘彦成，朱贤立. 硫酸镁对弥漫性脑损伤脑组织的保护作用及机制[J]. 中华实验外科杂志，2009，26（8）：144-145.

[5] 史建国，董亚楠，高军，等. 急性颅脑损伤患者血清Mg2+、IL-6、IL-8的动态监测研究[J]. 医学信息（上旬刊），2010， 23（10）：143-145.

[6] 刘红峰，范秀芳，郝素媛，等. 孕母产前应用硫酸镁对低出生体重儿血镁水平和新生儿期脑损伤的影响[J]. 中国优生与遗传杂志，2005，13（12）：156-157.

[7] 秦峰，高超，张浩，等. 硫酸镁对重型颅脑损伤患者神经功能的影响[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2009，3（6）：117-120.

[8] 杨南瑜，沈伟峰，许燕球. 血清镁与颅脑损伤严重程度及预后的相关性[J]. 中国医药科技，2012，47（14）：144-145.

[9] Zhang XS，Zhang X，Wu Q，et al. Astaxanthin alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats：possible involvement of akt/bad signaling[J]. Mar Drugs，2014，12（8）：4291-4293.

[10] Pattee GL，Wymer JP，Lomen-Hoerth C，et al. An open-label multicenter study to assess the safety of dextromethorphan/quinidine in patients with pseudobulbar affect associated with a range of underlying neurological conditions[J]. Curr Med Res Opin，2014，6（28）：1-11.

（收稿日期：2014-08-15）