结直肠癌组织中Thr187磷酸化p27kip1的表达及临床意义

郭志琴 吕青山 袁琳娜 张燕萍 邬万新

结直肠癌组织中Thr187磷酸化p27kip1的表达及临床意义

郭志琴 吕青山 袁琳娜 张燕萍 邬万新

目的探讨第187位苏氨酸（Thr187）磷酸化的细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（p27kip1，简称p27）（P-p27Thr187）在结直肠癌发生、发展中的作用及其与结直肠癌临床病理特征的关系。方法收集行手术切除的80例结直肠癌组织标本，以及6对新鲜结直肠癌和相应癌旁正常组织标本；采用免疫组织化学EnVision二步法和蛋白质印迹法检测结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中P-p27Thr187和p27的表达；并分析其与结直肠癌临床病理特征的关系。结果免疫组织化学和蛋白质印迹结果均显示，P-p27Thr187在结直肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织；结直肠癌组织中P-p27Thr187阳性表达率为100．0%（80/80），高表达者52例（65．0%，52/80），低表达者28例（35．0%，28/80）；而癌旁正常组织中P-p27Thr187阳性表达率为13．8%（11/80），与结直肠癌组织比较差异有统计学意义（P＜0．05）；p27在结直肠癌组织中的阳性表达率为48．8%（39/80），癌旁正常组织中为90．0%（72/80），两组比较差异有统计学意义（P＜0．05）；P-p27Thr187阳性表达与肿瘤细胞分化程度和TNM分期有关（均P＜0．05）；P-p27Thr187表达强度与细胞增殖指标Ki-67表达强度呈正相关（r=0．487，P＜0．05），与p27表达强度呈负相关（r=-0．394，P＜0．05）。结论结直肠癌组织中P-p27Thr187的异常表达可能参与了结直肠癌的发生、发展过程，其有助于综合评估结直肠癌的生物学行为，对结直肠癌的预后判断及诊治具有一定的参考价值。

结直肠肿瘤 p27kip1磷酸化 临床病理特征

细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白（p27kip1，简称p27）是重要的细胞周期负性调控因子，其蛋白表达及活性改变与肿瘤的发生、发展有关[1]。肿瘤细胞存在多种转录后调控机制来调节p27的表达，磷酸化是重要的途径之一[2-3]。第187位苏氨酸（Thr187）的磷酸化可启动细胞S期激酶相关蛋白2（Skp2）介导的p27多聚泛素化及随后的蛋白酶体降解，影响细胞内p27的水平[3]。然而目前国内外关于Thr187磷酸化p27（P-p27Thr187）在结直肠癌中表达的报道甚少。因此本研究通过检测结直肠癌组织中P-p27Thr187的表达，探讨Thr187磷酸化在结直肠癌发生及判断预后中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 材料 收集我院2007年1月至2008年12月行手术治疗并经病理检查证实为结直肠癌的患者标本80例，以及每例标本距肿瘤边缘5cm以上的癌旁正常组织。其中男52例，女28例；年龄31～82岁，平均63.7岁。肿瘤大小：长径1.5～10.0cm，平均4.6cm；肿瘤部位：左半结肠19例，右半结肠26例，直肠35例；浸润深度：T12例，T28例，T370例；淋巴结转移：N132例，N048例；大体类型：隆起型28例，溃疡型39例，浸润型13例；组织学类型：中分化腺癌62例，低分化腺癌13例，黏液腺癌5例；根据美国癌症联合会（AJCC）第7版结直肠癌TNM分期标准：Ⅰ期8例，Ⅱ期39例，Ⅲ期31例，Ⅳ期2例。所有患者术前均未接受任何放、化疗或其他辅助治疗。另收集结直肠癌手术切除的6对新鲜结直肠癌及癌旁正常组织用于蛋白提取。本研究经医院伦理委员会同意批准，并获得患者或其家属的知情同意。

1.2 主要试剂 兔抗人p27多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗人P-p27Thr187多克隆抗体（美国Zymed公司）；小鼠抗人Ki-67单克隆抗体（福州迈新生物技术有限公司）；HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG和β-actin单抗（美国Sigma公司）；ECL（美国Pierce公司）；免疫组织化学检测试剂盒（k5007，丹麦Dako公司）。

1.3 蛋白质印迹检测 6对新鲜结直肠癌及癌旁正常组织用2×SDS匀浆缓冲液裂解提取蛋白，紫外分光光度法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜，室温封闭（含10%脱脂奶粉的TBST）2h。一抗（p27，1∶800；P-p27Thr187，1∶1 000；β-actin，1∶2 000）分别室温孵育1h，4℃孵育过夜。HRP耦联的二抗（1∶1 000）室温孵育2h，ECL显色。Bio-Rad Quantity软件分析测定其区带的吸光度，β-actin为内参对照，用目的片段与β-actin的吸光度比值表示蛋白表达水平。

1.4 免疫组织化学染色和判定标准 按试剂盒说明，采用EnVision二步法，PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：Ki-67以细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性；P-p27Thr187和p27以细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，只有细胞质出现棕黄色颗粒为非特异性染色。每张切片选取5个有代表性的高倍视野（× 400），每个视野计数300个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分比。阳性细胞＜10%为-；10%～30%为+；31%～60%为++；＞60%为+++。-和+归为低表达，++和+++归为高表达。

1.5 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，P-p27Thr187和p27表达的相关分析采用Spearman等级相关。

2 结果

2.1 蛋白质印记检测P-p27Thr187和p27在结直肠癌组织和对应癌旁正常组织中的表达 见图1。

由图1可见，蛋白质印迹检测结果显示，本组6对新鲜结直肠癌及癌旁正常组织中，P-p27Thr187在癌组织中表达强度明显高于对应癌旁正常组织，而p27在癌组织中的表达强度明显低于癌旁正常组织。

2.2 免疫组化染色检测结直肠癌组织P-p27Thr187和p27的表达 见图2。

由图2可见，免疫组化染色结果显示，结直肠癌组织中P-p27Thr187表达较强，阳性染色主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，细胞质亦可见少量表达，而癌旁正常组织中表达较弱或不表达；p27在细胞核或细胞质染成棕黄色或棕褐色颗粒，癌旁正常组织中高表达，主要定位于细胞核，而癌组织中表达较低，且在细胞质和细胞核弥漫分布。本组结直肠癌组织中P-p27Thr187阳性表达率为100.0%（80/80），其中高表达者52例（65.0%，52/80），低表达者28例（35.0%，28/ 80）；而癌旁正常组织中P-p27Thr187阳性表达率为13.8%（11/80），与结直肠癌组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，本组结直肠癌组织中p27阳性表达率为48.8%（39/80），高表达者10例（12.5%，10/80），低表达者70例（87.5%，70/80）；而癌旁正常组织中p27阳性表达率为90.0%（72/80），与结直肠癌组织比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 P-p27Thr187和p27表达与结直肠癌临床病理特征的关系 见表1。

由表1可见，P-p27Thr187在结直肠癌组织中的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位等无关（均P＞0.05），而与肿瘤细胞分化程度和TNM分期有关（均P＜0.05）。p27表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位等无关（均P＞0.05），而与肿瘤细胞分化程度、TNM分期有关（均P＜0.05）。

2.4 结直肠癌组织中P-p27Thr187和p27表达的相关性 结直肠癌组织中P-p27Thr187表达强度与细胞增殖指标Ki-67表达强度呈正相关（r=0.487，P＜0.05），与p27表达强度呈负相关（r=-0.394，P＜0.05）；而p27表达强度与Ki-67表达强度呈负相关（r=-0.515，P＜0.05）。

图2 免疫组化染色检测结直肠癌组织P-p27Thr187和p27的表达（A：P-p27Thr187在癌细胞内高表达；B：p27在癌细胞核和细胞质弥漫分布；EnVision法，×100）

3 讨论

结直肠癌已成为危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率呈明显上升趋势，病死率已高居前3位，且确诊时多已到中晚期，预后较差，严重影响患者生活质量[4]。结直肠癌的确切发病机制目前尚未清楚。大量研究资料表明结直肠癌的发生、发展与细胞周期失调控密切相关。p27是一种非特异的细胞周期素依赖性激酶抑制剂，能够与多种cyclin-CDK复合物结合并抑制其活性，从而阻断细胞周期的进程。各种原因引起的p27表达改变和功能异常均可导致恶性肿瘤的发生。程翅等[5]发现p27在结肠癌中的低表达与结肠癌的细胞分化程度、转移和肿瘤临床分期有关。陈积贤等[6]研究发现结直肠癌组织中存在p27基因启动子甲基化，且p27基因的高甲基化与结直肠癌分化程度、浸润深度、Dukes分期及有无淋巴结转移有关，提示其可作为结直肠癌临床生物学行为的观测指标。p27的表达调控也依赖于转录后机制，包括Skp2介导的泛素-蛋白酶体降解途径[7]。有研究表明，Thr187的磷酸化修饰是激活p27蛋白泛素化降解的必要条件，干扰该位点的磷酸化能直接削弱Skp2介导的降解途径，并导致细胞周期阻滞[8]。

已有研究显示，P-p27Thr187在乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤中异常高表达，且与肿瘤的恶性程度有关[9-10]。本研究发现P-p27Thr187表达与结直肠癌的发生及临床病理因素密切相关。蛋白质印记和免疫组化结果均显示，P-p27Thr187在结直肠癌中的表达强度明显高于在对应癌旁正常组织的表达强度，而p27在癌组织中的表达强度明显低于正常癌旁组织。这与上述文献报道相似，提示P-p27Thr187的异常表达与结直肠癌的发生有关，Thr187的异常磷酸化可加速p27泛素化降解，细胞内p27水平降低，使其对细胞周期的负性调节作用较弱，导致抑瘤活性降低，引起结直肠癌的发生。本研究结合结直肠癌患者的临床病理资料分析发现，P-p27Thr187表达与肿瘤细胞分化程度和TNM分期有关，提示Thr187的异常磷酸化可能是结直肠癌的重要恶性表型特征之一，与结直肠癌的恶性进展有关，P-p27Thr187高表达提示患者可能预后不良。相关分析结果显示，结直肠癌组织中P-p27Thr187表达强度与细胞增殖指标Ki-67表达强度呈正相关，与p27表达强度呈负相关，提示Thr187磷酸化对p27的蛋白表达和生物学活性发挥重要的调控作用，并且与癌细胞的异常增殖有关。但P-p27Thr187在结直肠癌发生中的具体调控机制需进一步从细胞和分子水平深入探讨。

表1 P-p27Thr187和p27表达与结直肠癌临床病理特征的关系[例（%）]

研究表明，p27主要在细胞核内发挥作用，其细胞定位与其功能活性密切相关[11-13]。程翅等[5]研究发现，结肠癌中p27蛋白阳性表达主要定位于细胞质，细胞核仅少部分表达，偶见细胞质与细胞核同时表达。本研究显示，p27在癌旁正常组织中高表达，阳性信号主要定位于细胞核，而在结直肠癌组织中表达相对较低，且在细胞质和细胞核弥漫分布，这证实了上述观点，提示在结直肠癌细胞中p27有出核转运的趋势，p27分布的异常调控可使细胞周期失控、肿瘤形成。上述结果表明，p27在结直肠癌发病过程中扮演重要角色，Thr187的异常磷酸化是细胞癌变中的重要事件。然而，对于p27的出核转运和错位分布的具体调控机制，以及在此过程中Thr187磷酸化是否发挥主导作用还有待进一步阐明。

综上所述，结直肠癌中存在P-p27Thr187的异常表达。P-p27Thr187表达的增加与p27表达的降低有关，Thr187磷酸化异常可能通过影响p27的蛋白表达导致细胞周期调节紊乱并促进细胞异常增殖，从而加速结直肠癌的恶性进展。检测P-p27Thr187有助于综合评估结直肠癌的生物学行为特性，对结直肠癌的预后判断及诊治具有一定的参考价值。

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Expression of Thr187 phosphorylated p27kip1protein in patients with colorectal cancer and its clinical significance

ObjectiveTo investigate the expression of Thr187 phosphorylated p27kip1(P-p27Thr187)protein in colorectal cancer and its clinicopathological significance．MethodsThe expression of P-p27Thr187 and p27 was detected by immunohistochemical EnVision method and Western blot in 80 specimens of colorectal cancer tissue and 6 paired specimens of colorectal cancer and adjacent normal tissue,ResultsThe positive expression rates of P-p27Thr187 in colorectal cancer tissue was 100．0%(80/80),including high expression in 52 cases(65．0%,52/80),low expression in 28 cases(35．0%,28/80);while the positive expression rates in adjacent normal tissue was 13．8%(11/80)(P＜0．05)．The positive expression rates of p27 in colorectal cancer and adjacent normal tissue were 48．8%(39/80)and 90．0%(72/80),respectively(P＜0．05)．The expression of P-p27Thr187 was correlated with tumor differentiation and TNM stage (all P＜0．05);and its expression was positively correlated with proliferation index Ki-67(r=0．487,P＜0．05),and negatively correlated with p27(r=-0．394,P＜0．05)．ConclusionThe abnormal expression of P-p27Thr187 may be involved in the development and progression of colorectal cancer,it might be used as a novel diagnostic marker and therapeutic target in patients with colorectal cancer．

Colorectal cancer p27kip1Phosphorylation Clinicopathological features

2014-12-22）

（本文编辑：李媚）

浙江省医学重点学科建设计划（GJJX-010-001）；嘉兴市科技计划项目（2013AY21042-3）；嘉兴市第一医院“启明星”计划（2013QMX003）

314000 嘉兴市第一医院病理科（郭志琴、袁琳娜、张燕萍、邬万新），检验科（吕青山）

郭志琴，E-mail：guozhq@foxmail.com