新疆不同产地石榴皮品种优选

常占瑛，刘桂花，陈雪珊，高晓黎，古丽巴哈尔·卡吾力＊（.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 8300；.新疆药物研究所，乌鲁木齐 830004）

新疆不同产地石榴皮品种优选

常占瑛1，刘桂花2，陈雪珊1，高晓黎1，古丽巴哈尔·卡吾力1＊（1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆药物研究所，乌鲁木齐 830004）

目的 通过综合评分筛选出最优石榴皮品种。方法 采用高效液相色谱法测定没食子酸、鞣花酸含量；紫外分光光度法测定总多酚含量。结果 没食子酸在10.88～348μg·mL－1范围内，线性关系良好（r＝0.999 8），鞣花酸在9.94～318μg·mL－1范围内，线性关系良好（r＝0.999 9），没食子酸在1.1～7.7μg·mL－1范围内，线性关系良好（r＝0.999 9）。结论 通过综合评分筛选出喀什市酸石榴皮为最优品种。

石榴皮；没食子酸；鞣花酸；总多酚

石榴（Punica granatumL.）为石榴科石榴属植物，是一种药食同源的植物资源，石榴的汁、果皮、花、叶、籽、根皆可入药，具有抗氧化、清除自由基、预防心脑血管疾病、调节血脂、抗病毒、抗癌及改善妇女更年期综合征等多种生理和药理活性［1］。石榴皮含有多酚、黄酮、氨基酸、微量元素等多种化学成分，1995年版《中国药典》开始规定石榴皮主要成分鞣质的量不得低于10%。鞣质（tannins）又称单宁，是存在于绿茶、葡萄、蓝莓和石榴等植物中的一类多元酚类化合物，但石榴多酚比茶多酚、葡萄多酚等的抗氧化性、抗菌活性和抗动脉粥样硬化作用更显著［2］。石榴多酚主要存在于石榴果皮中，约为其干质量的10.4%～21.3%，石榴皮多酚主要成分包括安石榴苷（punicalagin）、鞣花酸、石榴皮鞣素和没食子酸等，据大量文献报道［3－5］，没食子酸具有抗肿瘤、抗突变、抗氧化、杀虫等多种功效。鞣花酸能与金属离子螯合，并能与自由基反应，从而具有抗氧化功能［6］，鞣花酸同时还可以抗肺癌、食管癌［7］。药理实验也表明，石榴皮具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用。因此测定石榴皮中总多酚、没食子酸、鞣花酸的含量，可以从一定程度上反映其内在质量。新疆气候干燥，夏季酷热，降水稀少，非常适宜种植石榴，但该地区石榴品种较多，地区与地区之间的差异较大，筛选出较优产地的石榴皮品种可以为以后的科学研究奠定一定的基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV－2550PC可见－紫外分光光度计（岛津制作所）；Sartorius BS110S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；EYELA N－1001旋转蒸发器；循环水式多用真空泵（郑州长城科教仪器有限公司）；LC－10ATVP高效液相色谱仪（日本岛津）、SPD－10AVP检测器。

1.2 试药 没食子酸对照品（批号为110831－200302，中国药品生物制品检定所，质量分数98%）；鞣花酸对照品（批号为110831－200302，中国药品生物制品检定所，质量分数为98%）；甲醇为色谱纯；水为双蒸水；磷酸、乙醚均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 石榴皮中没食子酸的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB－C18（250mm ×4.6mm，5μm）；流动相：2mL·L－1磷酸－甲醇（97∶3）；流速：0.8mL·min－1；检测波长：273nm；柱温30℃［810］；进样量：10μL。在此条件下，没食子酸与供试品中其他组分色谱峰可达基线分离，分离度大于1.5，保留时间适中。对照品和样品的色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品8.7mg，置于25mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀。制成每1mL含没食子酸0.348mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3 没食子酸标准曲线的绘制 精密吸取没食子酸对照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，依次稀释，得不同系列质量浓度的溶液，分别吸取10μL进样，以峰面积Y、没食子酸含量X进行线性回归，得回归方程：Y＝69 602 X＋6 733.1，r＝0.999 8（n＝6），没食子酸在10.88～348μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.1.4 供试品溶液的制备 精密称取不同产地石榴皮粉末约20g，加HCl（1→9）250mL，乙醚250mL，回流水解2.0h，过滤，提取2次，合并滤液，蒸干，甲醇溶解，定容至100mL，摇匀，吸取1mL稀释至50mL，用微孔滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液在同一天内重复进样5次，连续测定3d，计算日内、日间标准差。结果表明，日内及日间标准差均小于2%，说明本法比较稳定，重复性好。

2.1.6 重复性实验 精密称定5份样品，按2.1.4项方法制成供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件测定没食子酸含量，平均含量为2.41mg·g－1，RSD为1.77%，表明本方法重复性符合分析要求。

2.1.7 稳定性实验 取供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24，36和48h进样测定，以峰面积计算，考察其48h内的稳定性。结果RSD为1.37%，表明样品溶液在48h内稳定。

2.1.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品细粉适量，加入定量的没食子酸对照品溶液，按2.1.4项方法制备溶液和测定，计算回收率，9次测得没食子酸平均回收率为100.39%，RSD为1.19%，表明分析方法准确，见表l。

表1 没食子酸加样回收实验结果Tab.1 The results of recovery tests of gallic acid （n＝9）

2.2 石榴皮中鞣花酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB－C18（250 mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇－乙酸乙酯－磷酸二氢钾／磷酸（0.05mol·L－1）（32∶2∶66）；流速：1 mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：254nm［11］；进样量：10μL。在此条件下，鞣花酸与供试品中其他组分色谱峰可达基线分离，分离度大于1.5，保留时间适中。对照品和供试品的色谱图见图1。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸对照品15.9mg，置于50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。制成每1mL含鞣花酸0.318mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3 鞣花酸标准曲线的绘制 精密吸取鞣花酸对照品溶液5mL，置于10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，依次稀释，得不同系列质量浓度的溶液，分别吸取10μL进样，以峰面积Y、鞣花酸含量X进行线性回归，得回归方程：Y＝6 047.5 X＋7 516.3，r＝0.999 9（n＝6），鞣花酸质量浓度在9.94～318μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.2.4 供试品溶液的制备 精密称取不同产地石榴皮粉末约1.0g，加体积分数70%丙酮100mL，浸渍约14h，超声处理30min，滤过，残渣用体积分数70%丙酮30mL洗涤，合并滤液和洗涤液，用旋转蒸发仪蒸干丙酮溶液，加体积分数50%的甲醇溶液100 mL（内含1.2mol·L－1的盐酸），90℃回流8h，再用旋转蒸发仪浓缩至干，残渣用甲醇溶解，定容于100 mL量瓶中。精密吸取10mL，置于50mL量瓶中，用甲醇定容，0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.2.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液在同一天内重复进样5次，连续测定3d，计算日内、日间标准差，结果表明，日内及日间标准差均小于2%，说明本法比较稳定，重复性好。

2.2.6 重复性实验 精密称定5份样品，按2.2.4项方法制成供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件测定鞣花酸含量，平均含量为89.30mg·g－1，RSD为1.43%，表明本方法重复性符合分析要求。

2.2.7 稳定性实验 取供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24，36和48h迸样测定，以峰面积计算，考察其48h内稳定性。结果RSD为1.26%，表明样品溶液在48h内稳定。

2.2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品细粉适量，加入定量的没食子酸对照品溶液，按2.1.4项方法制备溶液和测定，计算回收率，9次测得没食子酸回收率为99.89%，RSD为1.43%，表明分析方法准确，见表2。

表2 鞣花酸加样回收实验结果Tab.2 The results of recovery tests of ellagic acid （n＝9）

2.3 石榴皮中总多酚的含量测定

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品5.5mg，置于100mL棕色量瓶中，蒸馏水溶解至刻度，摇匀。制成每1mL含没食子酸0.055mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.2 标准曲线的绘制 精确吸取上述没食子酸对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和3.5mL，置于25 mL棕色量瓶中，分别加入磷钼钨酸试液1mL，再分别加水10.5，10，9.5，9，8和7.5mL，用290g·L－1碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min，以相应的试剂为空白，照紫外－可见分光光度法在760nm波长处测定吸光度［12］，以吸光度A和质量浓度C进行线性回归，得回归方程：A＝0.096 9 C＋0.060 8，r＝0.999 9（n＝6），没食子酸在1.10～7.70μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.3.3 供试品溶液的制备 称取20g石榴皮粉末，置于1 000mL圆底烧瓶中，加入体积分数60%乙醇200mL，回流提取1h，过滤，真空浓缩，得石榴皮总多酚提取物，蒸馏水定容至100mL，精密吸取1mL稀释至25mL，精密吸取2mL溶液，置于25mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1mL，加水9mL，用290g·L－1碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白，照紫外－可见分光光度法在760nm波长处测定吸光度。

2.3.4 精密度实验 精密吸取对照品溶液，在同一天内重复进样5次，连续测定3d，计算日内、日间标准差，结果表明，日内及日间标准差均小于2%，说明本法比较稳定，重复性好。

2.3.5 重复性实验 精密称定5份样品，按2.3.3项方法制成供试品溶液，测定总多酚含量，平均含量为179.80mg·g－1，RSD为1.23%，表明本方法重复性符合分析要求。

2.3.6 稳定性实验 取供试品溶液，分别于0，2，4， 6，12，24，36和48h迸样测定，以峰面积计算，考察其48h内的稳定性。结果RSD为1.43%，表明样品溶液在48h内稳定。

图1 HPLC图A.没食子酸对照品；B.供试品1；C.鞣花酸对照品；D.供试品2Fig.1 HPLC chromatogramsA.standard solution of gallic acid；B.test samples 1；C.standard solution of ellagic acid；D.test samples 2

2.4 实验结果 新疆气候干燥、光照时间充足，石榴产量较大，品种较多，我们采集了新疆石榴产量较大的13个品种，通过分别测定石榴皮中没食子酸、鞣花酸、总多酚的含量，利用综合评分筛选出最优石榴皮品种，综合评分如下：石榴皮的综合评分＝鞣花酸／最大鞣花酸×30＋没食子酸／最大没食子酸×30＋总多酚／最大总多酚×40，结果见表3。

表3 不同产地的石榴皮中有效成分的含量测定及综合评分Tab.3 The content and comprehensive score of effective components in pomegranate peel from different regions

由表3可以看出，新疆不同地区出产的石榴皮中没食子酸的含量差异较大，喀什市叶城县酸石榴皮中没食子酸的含量最高，达到4.64mg·g－1，和田皮亚曼石榴皮中没食子酸的含量最低，只有1.30 mg·g－1，同一地区酸石榴比甜石榴没食子酸含量高。石榴皮中鞣花酸的含量较高，喀什市酸石榴皮中鞣花酸含量高达104.5mg·g－1，石榴皮中总多酚以阿图什松他克乡酸石榴含量最高，达到185.02 mg·g－1，石榴皮中总多酚、没食子酸、鞣花酸均是同一地区酸石榴高于甜石榴，提示酸石榴口感较差可能与石榴中鞣质含量较高有关。

通过对新疆不同石榴品种皮中没食子酸、鞣花酸、总多酚进行测定和综合评分比较，酸石榴评分均高于甜石榴，喀什市酸石榴皮综合评分最高，表明喀什市酸石榴皮中鞣质含量较高，和田皮亚曼石榴皮综合评分最低，皮中鞣质含量最低。

3 讨论

本实验比较了新疆不同产地的酸、甜石榴皮中有效成分，选取没食子酸、鞣花酸、总多酚为指标，采用综合评分法进行筛选，结果表明，不同石榴品种皮中有效成分存在差异，这主要与每一地区的光照、气候、雨水以及田间管理可能有关。

曾尝试用甲醇或丙酮提取石榴皮中没食子酸，用乙腈－1mL·L－1磷酸（10∶90）、甲醇－1mL·L－1磷酸（8∶92）、甲醇－四氢呋喃－冰乙酸－水（0.1∶0.5∶2∶97.4）、甲醇－0.5mL·L－1磷酸（5∶95）等溶剂系统作流动相，结果分离度较差，干扰峰较多，采用水与乙醚进行提取，甲醇－2mL·L－1磷酸（3∶97）作为流动相进行分离，结果干扰峰较少，分离度较好，方法重复性好，测定结果稳定、可靠。

通过综合评分筛选出喀什市酸石榴皮评分最高，和田市皮亚曼石榴皮评分最低，酸石榴皮评分普遍比甜石榴皮高，酸石榴酸涩，鞣质含量较高于甜石榴。

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Screening of pomegranate peel from different regions in Xinjiang

CHANG Zhanying1，LIU Guihua2，CHEN Xueshan1，GAO Xiaoli1，Gulibahar KAWUL1＊（1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Institute of Meteria Medica，Urumqi 830004，China）

Objective Through the comprehensive score method to screen the optimal pomegranate variety.Methods The gallic acid and ellagic acid contents were analyzed by HPLC；The total polyphenol content was analyzed by ultraviolet spectrophotometry.Results The linear range of gallic acid was 10.88－348μg·mL－1（r＝0.999 8），ellagic acid was 9.94－318μg·mL－1（r＝0.999 9），and gallic acid was 1.1－7.7μg·mL－1（r＝0.999 9）.Conclusion Through comprehensive evaluation pomegranate from Kashi city was selected.

pomegranate；gallic acid；ellagic acid；total polyphenol

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.009

R284

A

1004－2407（2015）04－0358－04

2014－02－18）

新疆医科大学2013年科研创新基金（编号：XJC201305）

常占瑛，男，实验师

＊通信作者：古丽巴哈尔·卡吾力，女，副教授