反相－混合柱色谱串联MS法探索中药半夏的化学成分

徐文英，刘春生，冯孟鑫，马恺悦，高山山，侯文珍，王佳宇，马长华（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

反相－混合柱色谱串联MS法探索中药半夏的化学成分

徐文英，刘春生，冯孟鑫，马恺悦，高山山，侯文珍，王佳宇，马长华＊（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

目的 对中药半夏中在C18色谱柱上保留较弱的化学成分进行分离与鉴定。方法 首先采用Waters X－Bridge C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）对半夏药材酸水提取液进行分离，然后对半夏提取液中在C18柱上保留较弱的成分采用Tech MateTX色谱柱（120A，150mm×2.0mm，5μm）（SCX与反相C18混合填料色谱柱）进行进一步分离分析，最后采用LC－MS对所分离成分进行鉴定，ESI正离子模式扫描分析。结果 根据正离子模式下获得的各色谱峰的质谱数据，共检测到13个主要的化学成分，其中3个通过与文献对照或根据质谱裂解规律得到了确认，分别为：缬氨酸，腺嘌呤，精氨酸；化合物1，2，4，5，7，8和13推测为：5－羟甲基糠醛，6 H－purin－6－1，2－amino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），环－（缬氨酸－酪氨酸），环－（亮氨酸－酪氨酸），亮氨酸－异亮氨酸，（－）－pohakulin pohakuline，N－（1－（苯基乙酰基）－L－脯氨酰）甘氨酸乙酯，化合物9推测为某种环肽；化合物10和11由于缺乏相关对照品和相关文献报道，其结构有待进一步分析鉴定。结论 在C18柱上死时间内流出而不能很好分离的物质，在混合填料柱上得到了进一步分离，这说明在某种程度上，采用单一固定相不能很好分离的某些化合物可以采用混合固定相色谱柱达到进一步分离，尤其是在对复杂体系样品的分离及鉴定过程中，混合固定相色谱柱将具有良好的应用前景。

半夏；混合固定相；高分辨质谱

半夏为天南星科半夏属植物半夏（Pinellia ternate（Thunb.）Breit.）的干燥块茎，已有2 000多年的用药历史［1－2］。据统计，在558个中药处方中，半夏的使用频率居第22位。在传统用药中，半夏可用于燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结，外用可用于急性乳腺炎等。进一步研究还发现，半夏还具有抗肿瘤、护肝、抗生育、治疗冠心病、降血脂等多种重要作用［3］。目前，2010年版《中国药典》采用电位滴定法测定其总酸含量［4］，对半夏药材进行质量控制，此法灵敏快速，能在一定程度上反映半夏的质量。但半夏成分复杂，指标性成分不明确，本课题组在半夏药材一维色谱指纹图谱建立的过程中，发现某些在C18为固定相的色谱柱上死体积内流出的物质往往会被忽略，而这些物质中亦可能含有与药效相关的成分。

研究表明，采用2种选择性差别较大的固定相填料混合后装柱，混合固定相色谱柱具有不同于2种单一固定相的选择性［5］。为将半夏药材中在单纯C18色谱柱上保留较弱的成分进行进一步的分离分析，本实验采用C18色谱柱及Tech MateTX色谱柱（SCX与反相C18混合填料色谱柱）构建离线二维色谱，将半夏药材中在单纯C18色谱柱上保留较弱的成分（前5min内流出的成分）进一步采用Tech MateTX色谱柱进行分离分析，并采用LC－MS对所分离的成分进行鉴定，以期获得半夏药材中尽可能多的化学成分信息，同时对混合固定相填料的色谱柱在中药分离分析中的适用性进行初步探索。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 1525高效液相色谱仪（Waters 2707自动进样器，柱温箱，Waters 2998二极管阵列检测器，Waters 1525泵，breeze TM2色谱工作站）；LTQ Orbitrap XL质谱仪与Accela高效液相色谱仪（Thermo公司）；分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；pH计（PB－10）；KQ－300GVDV型超声仪（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药 半夏药材，购自北京华邈医药公司，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎；乙腈（Fisher公司）为色谱纯；流动相用水为娃哈哈纯净水；甲酸、甲酸铵（分析纯，北京化工厂）。

2 实验方法

2.1 第一维色谱分析条件

2.1.1 供试品溶液的制备 取60℃干燥至恒质量的样品粉末（60目）5g，精密称定，加入体积分数75%的酸性乙醇（体积分数1%盐酸）溶液50mL，冷浸过夜，超声提取30min，放冷，称质量，过滤，用体积分数75%酸性乙醇（体积分数1%盐酸）5mL，洗涤滤渣和滤器，合并滤液及洗液，备用。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Waters X－Bridge C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇（B）：水（A），梯度洗脱：0～10min99.5%～99%A，10～15 min99%～98.5%A，15～30min98.5%～94.5%A，30～35min94.5%～90%A，35～45min90%～85% A，45～50min85%～74%A，50～62min74%～67% A，62～87min50%～50%A，87～92min50%～99.5%A；流速：1mL·min－1；检测波长：254nm。2.1.3 样品测定 供试品溶液过0.45μm滤膜后，按2.1.2项下色谱条件进样50μL，记录其色谱图，如图1所示。

2.2 第二维混合色谱柱串联MS分析条件

2.2.1 供试品溶液制备 SunFireTMPrep C18色谱柱（150mm×10mm，10μm）；按2.1.2项下梯度洗脱条件进样100μL，流速：2.17mL·min－1；收集前5min内流出的组分，冷冻干燥，加入10mL体积分数30%的乙腈甲酸水（pH＝3.0）溶液溶解，备用。

2.2.2 色谱条件 色谱柱（120A，150mm×2.0 mm，5μm）；流动相：乙腈－甲酸水溶液（pH＝3.0）30∶70（A），50mmol·L－1甲酸铵水溶液（甲酸调pH＝3.0）50∶50（B），梯度洗脱：0～30min100%～50% A，30～50min50%～50%A，50～60min50%～0% A，60～80min0%～0%A，80～83min0%～100% A；柱温：20℃，流速：0.2mL·min－1，进样量：20μL。

2.2.3 质谱条件 检测模式为：ESI＋，毛细管温度为275℃，喷雾电压为4.5kV，雾化气（N2）压力40 Psi，干燥气（N2）流速10.0L·min－1，扫描范围为m／z＝50～1 500，数据采集系统为Xcalibur v2.0.7。2.2.4 样品测定 供试品溶液过0.45μm滤膜后，按2.2.2项下色谱条件进样20μL，按照2.2.3项下质谱条件进行检测，记录其总离子流图及各个时间点对应的色谱图，部分样品的提取离子流图见图2，所鉴定化合物的保留时间与一级和二级质谱以及相关分子式信息见表1。

3 实验结果

半夏第一维色谱C18色谱柱色谱图见图1；部分化合物提取离子色谱图见图2。

图1 半夏第一维色谱C18色谱柱色谱图Fig.1 The first dimension chromatography on C18column of Pinellia ternata

图2 部分化合物提取离子色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms of the components

由图1可以看出，当流动相中水的比例高达99%时，半夏药材在C18色谱柱上前5min内流出的化合物仍未能得到较好分离，而此部分化合物中可能也含有与其药效相关的化合物。为此，本实验进一步采用Tech MateTX混合填料的色谱柱对此部分化合物进行进一步分离，以期探索得到半夏中更多的化合物信息。半夏第一维色谱前5min流出物质的HPLC－MS－MS分析的部分提取离子色谱图如图2所示。对比两图可知，在C18柱上前5min内被洗脱而未被很好分离的物质，在混合固定相的色谱柱上有了进一步分离。其中有6个色谱峰得到较好分离，结合HPLC的保留时间值以及参考文献报道，并根据所得到的一级质谱给出的准分子离子峰信息和所得到的二级质谱推测出的结构碎片信息，共推测出13个化学成分的可能结构，这些成分在前期文献中都曾有报道［6－7］，通过对比文献中相关化合物的一级和二级质谱信息，化合物3，6和12得到了确证，分别为：缬氨酸，腺嘌呤，精氨酸；化合物1，2，4，5，7，8和13推测为5－羟甲基糠醛，6 H－purin－6－1，2－a－mino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），环－（缬氨酸－酪氨酸），环－（亮氨酸－酪氨酸），亮氨酸／异亮氨酸，（－）－pohakulin pohakuline，N－（1－（苯基乙酰基）－L－脯氨酰）甘氨酸乙酯，化合物9推测为某种环肽；化合物10和11由于缺乏相关对照品和相关文献报道，因此其结构有待进一步分析鉴定。表1给出了所有化合物的保留时间与一级和二级质谱以及相关分子式信息。

表1 被鉴定化合物的保留时间、一级质谱、二级质谱和分子式Tab.1 The retention time and formula and MS1－MS2of the identification compounds

4 结论

由以上结果可以发现，采用C18色谱柱及混合填料色谱柱搭建离线二维液相色谱可以简单快速地分离鉴别半夏酸水提取液中极性较大的化学成分。此外，在C18填料色谱柱上保留较弱的物质（死时间内流出的物质）在混合填料色谱柱上有了进一步的分离，这说明，相比于单一C18填料而言，混合填料的色谱柱可以大大提高色谱柱的选择性，使样品的分析更有针对性，分离性能也优于单一固定相，进而改善HPLC分离。而且，将此种混合填料的色谱柱与MS串联使用时，还可以克服在实际分析检测工作中，尤其是复杂样品（如中药）的分析中的流动相不兼容的缺点，因此，混合填料的色谱柱在分析工作中具有良好的应用前景。本文仅初步探索了混合填料SCXC18＝1∶4的色谱柱，复杂的样品体系也只选择了中药材半夏中在C18色谱柱上死时间内较难很好分离的化合物体系，今后可以尝试诸如C8－SCX和C8－HILIC等更多的混合固定相体系，研究对象也可以放大为更多的成分复杂的中药材，进而对该类型的体系进行更深入地研究。可以相信，基于混合填料色谱原理不断优化出的色谱柱及其色谱体系会更好地应用于中药成分的分离分析及化合物的分离鉴定等分析领域。

［1］陈宏.半夏研究进展［J］.现代农业科技，2010，（5）：80－81.

［2］陈钢，崔小兵，谈献和，等.半夏药材中鸟苷和尿苷的含量测定及半夏指纹图谱研究［J］.西北药学杂志，2011，26（5）：313－316.

［3］姚军强.半夏的药理作用及其临床配伍运用［J］.中医研究，2013，26（2）：3－5.

［4］国家药典委员会.《中国药典》2010年版［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：89.

［5］傅若农.气相色谱混合固定相和其中的“协同效应”［J］.国外分析仪器，1997，7（1）：29－32.

［6］徐剑锟，张天龙，易国卿，等.半夏化学成分的分离与鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2010，27（6）：429－433.

［7］张之昊，戴忠，胡晓茹，等.半夏化学成分的分离与鉴定［J］.中药材，2013，36（10）：1620－1622.

Study on the chemical composition of traditional Chinese medicine Pinellia ternate by C18－mixed－stationary phase column LC－MS

XU Wenying，LIU Chunsheng，FENG Mengxin，MA Kaiyue，GAO Shanshan，HOU Wenzhen，WANG Jiayu，MA Changhua＊
（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To separate and identify the chemical compositions of Pinellia ternate which is slightly reserved on the C18column.Methods Firstly a Waters X－Bridge C18column was used to separate the acidic water extract of Pinellia ternate，and then the Tech MateTXcolumn（120A，150mm×2.0mm，5μm）（SCX－C18mixed stationary phase column）was used to separate the components that slightly retained on the C18column，and finally the components that slightly retained on the C18column were separated and identified by LC－MS－ESI in a positive ion mode.Results According to the positive ion mode available mass spectral data for each chromatographic peak，13major chemical constituents were detected，3of which were confirmed by literature or under the control of MS fragmentation mechanism.They were adenine，valine，and arginine.Compounds 1，2，4，5，7，8and 13were：5－hydroxymethyl furfural，6 H－purin－6－1，2－amino－1，9－dihydro－8－（1－naphthalenylamino），ring－（Val Tyr），cyclo（leu－tyr），leucine－isoleucine，（－）－pohakulinpohakuline，and N－（1－（phenylacetyl）－L－prolyl）glycine ethyl ester.Compound 9was presumed to be a cyclic peptide；due to the lack of control and related literatures，the structure of compounds 10and 11need to be identified for further analysis.Conclusion The substances which were flowed out in the dead time on the C18column can be separated on the mixed－stationary phase column.The mixed－stationary phase will has a good application prospects.

Pinellia ternate；mixed－stationary phase；high－resolution mass spectrometry

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.008

R284

A

1004－2407（2015）04－0354－04

2015－04－10）

北京市自然科学基金项目（编号：7142101）

徐文英，女，在读硕士研究生

＊通信作者：马长华，男，教授，硕士生导师