活血降脂保肝汤对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织Nrf2、PKB表达的影响

苏剑锋， 江 伟， 杨 静

（桂林医学院附属医院，广西桂林541001）

活血降脂保肝汤对非酒精性脂肪肝大鼠肝组织Nrf2、PKB表达的影响

苏剑锋， 江 伟*， 杨 静

（桂林医学院附属医院，广西桂林541001）

目的探讨活血降脂保肝汤对非酒精性脂肪肝大鼠的保肝降脂作用及该药方在治疗过程中可能的作用机制。方法将健康雄性SD大鼠60只随机分为6组，即正常组，模型组，活血降脂保肝汤低、中、高剂量组，强肝片组。除正常组外，其余各组给予高脂饮食。于第12周末采集血清标本检测各组大鼠天冬氨酸转氨酶 （AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、甘油三酯 （TG）、总胆固醇 （TC）水平，以及观察大鼠肝组织病理变化、核因子相关因子-2（Nrf2）、蛋白激酶B（PKB）的表达情况。结果与正常组比较，模型组TC、TG、ALT、AST均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，中药各剂量组及强肝片组TC、TG、ALT、AST水平显著降低，差异有统计学意义 （P＜0.01）；免疫组化检测结果显示：与正常组比较，模型组Nrf2表达水平升高，PKB表达水平降低，差异无统计学意义；与模型组比较，中药各剂量组及强肝片组Nrf2、PKB表达显著增强，差异有统计学意义 （P＜0.01），并以中药高剂量组尤为明显。大鼠肝脏病理切片显示活血降脂保肝汤可明显减轻肝细胞肿胀、脂肪变性及炎症细胞浸润。结论活血降脂保肝汤具有调节脂质代谢紊乱，有效逆转非酒精性脂肪肝模型大鼠肝组织脂肪变性的程度，改善大鼠血脂、肝功能，并上调组织中Nrf2、PKB表达的作用.这可能是其防治非酒精性脂肪肝病的作用机制之一。

活血降脂保肝汤；非酒精性脂肪肝；Nrf2；PKB

非酒精性脂肪肝病 （NAFLD）是一种无过量饮酒史，排除其他有明确损肝因素所导致的肝细胞脂肪变性、脂肪贮积并以肝细胞脂肪性变、气球样变、弥散性肝小叶轻度炎性反应或肝中央静脉、肝窦周围胶原沉积等为临床病理特征的慢性肝脏疾病临床综合征。随着我国经济水平高度发展，人们饮食结构的变化及生活水平的不断改善，NAFLD的患病率呈现逐年增长的趋势，并呈现出低龄化倾向。据有关资料统计，我国广州、上海成人NAFLD患病率分别约为15%和17%，广东青少年患病率约为13%。在过去的7～10年间，成年人NAFLD患病率增在我国发达地区加了一倍［1］。目前，作为我国仅次于病毒性肝炎的第二大肝病的NAFLD，也被公认为我们国家越来越严重的慢性肝脏疾病问题，严重危害着人们的健康［2］，正因如此，对于NAFLD防治的研究有着较为重要的意义。

活血降脂保肝汤是广西名中医江伟教授根据中医基础理论的指导下，结合了临床大量经验对 “活血降脂汤［3］（主要成分白术、地龙、川芎、赤芍、丹参等）”进行研究改良得之。活血降脂保肝汤以健脾、祛湿化痰、活血化瘀为主要治疗原则，药方中丹参、山楂、赤芍、田七、泽泻散结化瘀、活血利湿，黄芪、五味子补益脾气，川芎活血行气。综观全方，诸药合用，健脾、祛湿、化淤、消积之功彰显益彰，共奏脾运得健，肝体得养，肝用得畅，邪去正安之目的。本实验研究拟用高脂饮食诱导NAFLD模型，研究活血降脂保肝汤对NAFLD模型大鼠血脂、肝功能、Nrf2、PKB及肝脏病理形态的影响，探讨其降脂保肝作用及可能的作用机制，以期为该方在临床治疗NAFLD中提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD雄性大鼠 （SPF级）8周龄60只，体质量150～200 g，购于广西医科大学动物实验中心（合格证号SC桂2009-0002）。

1.1.2 主要药物及试剂 活血降脂保肝汤免煎剂 （丹参10 g、山楂10 g、赤芍10 g、黄芪10 g、泽泻10 g、川芎10 g、五味子10 g、田七6 g），购于桂林市中医院中药房；强肝片 （陕西永寿制药有限责任公司，国药准字Z20060401）；高脂饲料，源于对杨坤等［4］高脂饲料配比进行改良，72%基础饲料+10%玉米油 （中粮食品营销有限公司）+10%猪油 （自备）+3%胆固醇 （阿拉丁试剂上海有限公司，批号C104028）+5%蔗糖，由桂林医学院实验动物中心制备；Nrf2、PKB兔抗鼠多克隆抗体，购于ImmunoWay Biotechno1ogy Company公司；SP-9001二步法免疫组化试剂盒 （北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法与动物分组 自由进食进水，实验室条件大鼠适应性饲养1周后，随机数字表随机分为6组，即正常组，模型组，活血降脂保肝汤低、中、高剂量组，强肝片组，每组10只。正常组予普通饲料喂养，其他组均予高脂饲料喂养诱导NAFLD模型。

1.2.2 给药方法 各给药组2周后开始按大鼠的体质量进行药物干预。活血降脂保肝汤按等效临床剂量和体表面积公式［5］计算，活血降脂保肝汤低、中、高剂量组 （予以中药方免煎剂，质量浓度为2.4 g/m L）。强肝片组按67 mg/kg灌胃，正常组及模型组每日一次给予1 mL/100 g生理盐水灌胃，各组实验动物在实验室饲养条件下，每2周称体质量1次，并调整用药剂量。

1.2.3 取材 给药至第12周末 （标本采集前禁食不禁水12 h），大鼠以10%水合氯醛 （0.35 mL/100 g）溶液经腹腔内注射麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清，-20℃保存备用。脱颈椎处死大鼠，立即摘取肝脏，4℃冰浴灭菌生理盐水冲洗，滤纸吸干，称量肝脏质量。取相同部位肝右叶组织用10%甲醛溶液固定。

1.2.4 检测指标及方法

1.2.4.1 血清生化指标的检测 采用全自动生化分析仪分别对大鼠血清中AST、ALT、TG、TC等进行检测。

1.2.4.2 免疫组化法检测肝组织Nrf2、PKB表达 采用二步法，按试剂盒操作说明书进行，阴性对照用PBS代替一抗，细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒则为阳性表达，每张组织切片选取5个高倍镜视野 （×400）进行实验观察，结果用Image-p1us 6.0软件进行图像半定量分析，测定各实验组大鼠肝组织Nrf2、PKB阳性目标积分光密度，光密度值约高，Nrf2、PKB表达就越强。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行实验数据分析，数据以均数±标准差 （）表示，组间用单因素方差分析（one way-ANOVA）进行统计学分析。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 正常组大鼠毛色光泽，饮食、排泄物较正常，性情温顺，对外界刺激反应灵敏。模型组大鼠体毛发黄而干枯，体型肥胖，大便油腻感，对外界刺激反应迟钝，容易激惹。各药物干预组大鼠一般情况介于正常组和模型组大鼠之间。实验结束时，为判定造模是否成功而处死的5只实验大鼠以外，另有2只大鼠因灌胃给药过程中操作不当或不能耐受等原因而死亡。

2.2 大鼠体质量、肝质量变化 与正常组相比，中药低剂量组、模型组大鼠的体质量升高明显 （P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组大鼠的肝质量、体质量均有不同程度下降，差异具有统计学意义 （P＜0.01），其中以中药高剂量组的体质量、肝质量下降较为明显。具体见表1。

2.3 大鼠血清生化指标的变化

2.3.1 大鼠血清总胆固醇 （TC）和甘油三酯 （TG）浓度

与正常组相比，模型组、中药低剂量组血清TG、TC的含有量显著增高 （P＜0.01）；与模型组比较，各给药组的大鼠血清TC、TG均有明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），其中以中药高剂量组效果最佳，见表2。

表1 各组大鼠体质量、肝质量变化的比较 （）

表1 各组大鼠体质量、肝质量变化的比较 （）

注：与模型组比较，★★P＜0.01；与正常组比较，△△P＜0.01

/g正常组组别 动物数 体质量/g 肝质量10 367.95±23.98 8.74±0.67模型组 8 433.31±18.09△△ 14.26±1.50△△中药低剂量组 9 399.48±16.89△△★★12.31±1.45△△★★中药中剂量组 9 374.76±22.70★★ 10.16±0.88★★中药高剂量组 8 370.99±23.35★★ 9.59±1.25★★强肝片组 9 372.53±22.41★★ 10.18±1.23★★

表2 各组大鼠血清TG、TC的比较（）

表2 各组大鼠血清TG、TC的比较（）

注：与模型组比较，★★P＜0.01；与正常组比较，△△P＜0.01

组别 动物数 TG/（mmo1·L-1） TC/（mmo1·L-1）10 0.75±0.13 1.75±0.15模型组 8 1.21±0.18△△ 2.64±0.23△△中药低剂量组 9 0.98±0.10★★△△ 2.04±0.16△△★★中药中剂量组 9 0.86±0.15★★ 1.93±0.13★★中药高剂量组 8 0.79±0.13★★ 1.85±0.15★★强肝片组 9 0.89±0.11★★ 1.90±0.14正常组★★

2.3.2 大鼠血清中ALT、AST变化 与正常组比较，模型组、中药低剂量组血清ALT、AST明显升高，有显著性差异 （P＜0.01）；与模型组比较，各给药组的ALT、AST比较明显降低，差异具有统计学意义 （P＜0.01）；并以中药高剂量组表现较为显著。见表3。

表3 各组大鼠血清ALT、AST变化的比较（）

表3 各组大鼠血清ALT、AST变化的比较（）

注：与模型组比较，★★P＜0.01；与正常组比较，△△P＜0.01

组别 动物数 ALT/（U·L-1） AST/（U·L-1）10 40.02±6.29 133.35±7.91模型组 8 69.66±5.27△△ 229.37±28.67△△中药低剂量组 9 58.56±5.31△△★★ 188.92±16.41△△★★中药中剂量组 9 45.20±4.71★★ 147.65±6.81★★中药高剂量组 8 43.20±4.10★★ 145.21±4.92★★强肝片组 9 45.80±4.16★★ 148.10±6.22正常组★★

2.4 HE染色观察大鼠肝脏的组织形态学 （×400） 正常组：大鼠肝组织结构清晰完整，中央静脉分布均匀；小叶结构完整；肝细胞沿着肝窦排列整齐，呈放射状分布，大小一致，胞核结构居中清晰，肝细胞索排列整齐。模型组：大鼠肝组织呈弥漫性脂肪变性，肝细胞索不可见，肝小叶结构明显破坏；肝细胞肿胀、大小不均，细胞核居边，大量大小不等的脂滴挤满了胞浆，肝细胞内可见散在多个脂滴彼此融合形成较大的脂滴。活血降脂保肝汤高剂量组：肝小叶结构完整；肝细胞索整齐排列；肝小叶周边见少数气球样脂肪变性，细胞内胞浆丰富，细胞核大小正常，位置居中。见图1。

2.5 肝细胞Nrf2、PKB免疫组化图像分析 Nrf2阳性蛋白在肝细胞胞浆显色为棕黄色颗粒，PKB阳性蛋白阳性表达主要分布于中央静脉周围肝细胞胞浆以及部分内皮细胞有棕黄色颗粒沉着。在正常组大鼠肝细胞胞浆中有少量的Nrf2表达，呈弱阳性表达，PKB正常表达。与正常组比较，模型组中Nrf2表达稍见增强，PKB表达稍有减弱，差异均无统计学意义。分别与正常组、模型组比较各给药组Nrf2、 PKB阳性表达明显增强 （P＜0.01，P＜0.05），差异有统计学意义。见表4，图2、3。

图1 大鼠肝脏的组织HE染色 （×400）

表4 大鼠肝组织Nrf2免疫组化图像分析比较（）

表4 大鼠肝组织Nrf2免疫组化图像分析比较（）

注：与模型组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

积分光密度值正常组组别 动物数 Nrf2积分光密度 PKB 10 0.334±0.024 0.354±0.027模型组 8 0.363±0.037 0.325±0.026中药低剂量组 9 0.406±0.040△△★ 0.391±0.037★★△中药中剂量组 9 0.424±0.039△△★★ 0.446±0.037★★△△中药高剂量组 8 0.460±0.038△△★★ 0.486±0.039★★△△强肝片组 9 0.422±0.026△△★★ 0.436±0.041★★△△

图2 免疫组化（S-P）检测实验大鼠肝组织中Nrf2表达（×400）

图3 免疫组化（S-P）检测实验大鼠肝组织中PKB表达（×400）

3 讨论

目前无论是有关NAFLD的预防、发病机制及治疗的研究都已经成为现代医学研究的热点，但NAFLD发病机制较复杂，迄今仍未完全清楚。祖国中医学中没有非酒精性脂肪肝的记载，把本病归属于 “积证”“胁痛”“痰证”“肥气病”等范畴，最早记载见于 《难经》：“肝之积，名曰肥气”。中医认为NAFLD多与过食肥甘厚味，或劳逸失度，或素体肥胖，或外感湿热毒邪，或情志失调，或久病体虚等导致肝失疏泄、脾失健运，清浊不分，气血不畅，进而痰浊内蕴，湿邪内生，气机瘀滞，瘀阻肝络。痰浊、瘀血、湿热、气滞相互交结而发于本病。肝失疏泄、脾失健运共同成为脂肪肝形成的病理基础。痰湿、血瘀是形成本病的主要病理变化，也是其发病的重要因素。因此，活血化瘀、祛湿化痰可作为本病的基本治则。

在NAFLD发病过程中，1998年Day等提出“二次打击”学说［6］，认为肝脏的一次打击造成肝细胞内大量脂质沉积及血清中游离脂肪酸 （FFA）含有量增多，当体内FFA含有量增多超过机体对其清除能力时导致机体的氧化应激 （OS）及抗氧化能力失衡，在此基础上持续的胰岛素抵抗、氧化应激及脂质过氧化、细胞因子损伤、糖脂代谢紊乱等作用则为二次打击，在肝脏脂肪沉积发挥重要作用。近年来研究发现，Nrf2、PKB与非酒精性脂肪肝的发生、发展存在密切关系。核转录因子Nrf2具有高度保守的碱性亮氨酸拉链构 （bZIP），属于亮氨酸拉链转录因子家族成员，分子质量约为66 000。它最初是由Moip［7］等作为结合在β-珠蛋白基因启动子NF-E2重复序列的因子被克隆出来，Nrf2在体内普遍存在，如肺脏、肠道、肾脏、肝脏等，在组织、细胞防御氧化应激过程中具有调节因子的重要作用，通过与上游的抗氧化反应元件 （ARE）的结合之后，调控抗氧化酶基因的转录活性及下游ARE依赖的Ⅱ相解毒酶，包括血红素氧合酶 （HO-1）、谷胱甘肽-s-转移酶、超氧化物歧化酶 （SOD）和过氧化氢酶 （CAT）等［8］，保护细胞、组织免受毒害。Nrf2参与组织、细胞防御氧化应激过程，通常情况下，OS抑制E3泛素化作用的连接酶活化，进而激活Nrf2，其表达随之上调，激活依赖Nrf2的基因转录。一旦Nrf2表达发生障碍，细胞对OS的不耐受或耐受性以此减低，OS的负面效应赠大，细胞功能防御机能亦受抑制，严重时可引起死亡［9］。Nrf2对肝脏也有着多方面的影响，如解毒、调节肝脏的代谢、促进肝细胞再生，在脂肪肝、肝损伤、肝纤维化甚至肝癌等方面也具有保护作用［10］。研究［11］证明：敲除Nrf2之后，肝细胞炎症细胞浸润及肝脏脂质沉积加剧，肝脏氧化应激水平升高，进而增加JNK磷酸化水平而降低IRS-1酪氨酸磷酸化水平，加速小鼠肝脏胰岛素抵抗的发生，最终导致了NAFLD发生、发展。

蛋白激酶B（PKB/AKT）是原癌基因C-akt的表达产物，也称PKB/AKT，是胰岛素信号通路磷脂酰肌醇3-激酶 （PI-3K）途径中起关键信号分子作用。在肝脏中，至少有3种亚型：AKT1/PKBα，AKT2/PKBβ，AKT3/PKBγ，主要集中于中央静脉周围。PKB在结构组成上有三个功能结构域：C末端的调节结构域、N末端的PH域和中间的激酶/催化结构域。PH结构域可以介导与脂类之间的相互作用。在胰岛素诱导下，磷脂酰肌醇3-激酶 （PI-3K）途径中的上游信号逐级活化，磷酸化PKB的Thr308和Ser473位点随之活化，从膜上脱落下来，下游的信号蛋白活化或受到抑制，从而介导蛋白质合成、糖原合成、糖酵解、葡萄糖转运、脂质合成等代谢效应［12］。研究证明［13-14］，高脂饮食诱导的脂肪性肝病存在氧应激，氧化应激激活IKKβ炎症途径释放细胞核因子NFKB，同时使PI3K/PKB信号通路受阻，影响PKB的表达，导致信号转导途径障碍致使肝脏细胞受损。本研究结果显示，NAFLD模型组的Nrf2的表达的升高，PKB表达的降低提示与NAFLD的发生有一定的联系，经活血降脂保肝汤治疗后，Nrf2、PKB的表达均高于模型组，表明该中药方对NAFLD的肝细胞损伤有较好的修复作用，其作用机制可能与激活Nrf2、PKB的表达，从而诱发肝细胞抗氧化应激、脂质过氧化的保护机制，阻止了NAFLD的发展。ALT、AST均属于非特异性细胞内功能酶，作为衡量肝功能的重要指标，活血降脂保肝汤能明显降低NAFLD模型大鼠血清中TG、TC、ALT、AST的水平，说明其在调节脂质代谢紊乱、保护肝功能、改善血脂方面具有良好的治疗作用；活血降脂保肝汤有效干预大鼠非酒精性脂肪肝模型，进一步证实用药后肝组织修复及抗损伤能力增强，把Nrf2、PKB作为一个治疗靶点运用于NAFLD的治疗，将可能为临床治疗NAFLD开发提供了一定的理论依据和可行的思路。当然该方剂防治NAFLD可能是多层次、多途径、多环节不同药理作用交汇调控的结果，有关详细机制仍有必要作进一步的探讨和研究。

［1］范建高.中国非酒精性脂肪性肝病的流行病学［J］.中国医师进修杂志，2010，33（1）：4-6.

［2］Fan JG，Farre11G C.Epidemio1ogy of non-a1coho1ic fatty 1iver disease in China［J］.JHepatol，2009，50（1）：204-210.

［3］江 伟，张惠勤.活血降脂汤对高血压病高脂血症患者血脂的影响［J］.辽宁中医药大学学报，2006，8（5）：8.

［4］杨 坤，胡克章，黄正明，等.高糖高脂肪饲料诱导大鼠非酒精性脂肪肝模型的动态研究［J］.解放军药学学报，2010，26（6）：509-512.

［5］徐叔云，卞如濂.药理实验方法学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，1991：158.

［6］Day C P，James O F.Steatohepatitis：a ta1e of two“hits”？［J］.Gastroenterology，1998，114（4）：842-845.

［7］Moi P，Chan K，Asunis I，etal.Iso1ation of NF-E2-re1ated factor 2（Nrf2），a NF-E2-1ike basic 1eucine zipper transcriptiona1 activator thatbinds to the tandem NF-E2/AP1 repeatof the beta-g1obin 1ocus contro1 region［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（21）：9926-9930.

［8］孙 健，许伟华，周成军，等.Nrf2与非酒精性脂肪性肝病小鼠肝细胞凋亡的关系［J］.中国现代医学杂志，2011，21（4）：384-388.

［9］Sriram N，Ka1ayarasan S，Sudhandiran G.Epiga11ocatechin-3-ga11ate augments antioxidant activities and inhibits inf1ammation during b1eomycin-induced experimenta1 pu1monary fibrosis through Nrf2-Keap1 signa1ing［J］.Pulm Pharmacol Ther，2009，22（3）：221-236.

［10］Chowdhry S，Nazmy M H，Meakin P J，et al.Loss of Nrf2 marked1y exacerbates nona1coho1ic steatohepatitis［J］.Free Radic Biol Med，2010，48（2）：357-371

［11］倪 阵，闻勤生，赵曙光，等.Nrf2基因敲除对肝脏氧化应激及胰岛素抵抗的影响［J］.山西医科大学学报，2013，44（3）：169-173.

［12］Whiteman E L，Cho H，Birnbaum M J.Ro1e of Akt/protein kinase B in metabo1ism［J］.Trends Endocrinol Metab，2002，13（10）：444-451.

［13］Cai D，Yuan M，Frantz D F，et al.Loca1and systemic insu-1in resistance resu1ting from hepatic activation of IKK-beta and NF-kappaB［J］.Nat Med，2005，11（2）：183-190.

［14］Han JW，Zhan X R，LI X Y，et al.Impaired PI3K/AKT signa1pathway and hepatoce11u1ar injury in high-fat fed rats［J］. World JGastroenterol，2010，16（48）：6111-6118.

R285.5

B

1001-1528（2015）08-1828-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.044

2014-03-31

广西自然科学基金项目 （2014GXNSFBA402001）

苏剑锋，男，硕士。Te1：18377332572，E-mai1：doctorsif@163.com

*通信作者：江 伟 （1951—），男，教授，主任医师，硕士生导师，研究方向为消化系统疾病基础。Te1：13481398590，E-mai1：weijiang7802@163.com