参附注射液预处理对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用

李爱华， 李 倩， 白桂春， 朱世纯， 李宝丽， 周春美

（1.唐山职业技术学院，河北唐山063004；2.华北理工大学医学实验研究中心，河北唐山063000；3.丰润区人民医院，河北唐山063000；4.唐山市协和医院，河北唐山063004）

参附注射液预处理对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用

李爱华1， 李 倩2*， 白桂春1， 朱世纯3， 李宝丽4， 周春美1

（1.唐山职业技术学院，河北唐山063004；2.华北理工大学医学实验研究中心，河北唐山063000；3.丰润区人民医院，河北唐山063000；4.唐山市协和医院，河北唐山063004）

目的观察参附注射液预处理大鼠发生脑缺血再灌注时其神经功能、梗死脑组织体积、形态及显微结构等方面的变化，探讨参附注射液预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法120只健康雄性SD大鼠随机分为5组，即假手术组，缺血再灌注组 （模型组），参附注射液预处理高、中、低剂量组 （腹腔注射给药7 d，每天1次，第7天腹腔注射2 h后制作模型；给药剂量分别为20、10、5 mg/kg）。采用线栓法制作大脑中动脉缺血2 h再灌注模型，Longa 5分制评分评价大鼠行为学改变，TTC染色法检测脑梗死体积，再灌注24 h电镜观察缺血边缘区脑组织超微结构的变化。结果与假手术组对比，模型组大鼠脑组织梗死体积增大，差异有显著性 （均P＜0.05）；与模型组对比，参附注射液预处理各组大鼠脑梗死体积均呈现不同程度的减少，差异具有统计学意义 （P＜0.05，或P＜0.01）；电镜下，参附注射液预处理组大鼠脑组织超微结构损伤较模型组明显减轻，以高剂量组效果最为明显。结论参附注射液预处理对大鼠急性脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

脑缺血再灌注损伤；参附注射液预处理；大鼠MCAO模型

缺血性脑血管病是导致老年人死亡和致残的重要原因之一。目前，对抗缺血再灌注损伤是治疗缺血性脑血管病的关键环节，但在治疗上仍未取得重大突破。研究发现，经过物理、化学或药物性预处理方法可诱导产生脑缺血耐受，这一发现为缺血性脑血管病的治疗开拓了新方向［1］。参附注射液是由中医著名古方参附汤加工提炼而成，为红参和黑附片的提取物，主要药理成分为人参皂苷和乌头类生物碱［2］。人参皂苷对脑缺血性损伤的保护作用已有报道［3-6］，而参附注射液预处理能否减轻脑缺血再灌注损伤，这方面的研究较少。本课题通过对大鼠进行参附注射液预处理干预，行大脑中动脉阻断（midd1e cerebra1artery occ1usion，MCAO）再灌注模型，观察大鼠神经功能、梗死脑组织体积及其形态学与超微结构改变，探讨参附注射液预处理能否诱导脑缺血耐受并对大鼠急性脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠120只，体质量250～350 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2010-0013，在屏障环境动物实验室喂养，1周后进入实验。将大鼠随机分为5组：假手术组、缺血再灌注组 （模型组）、参附注射液预处理高、中、低剂量组，每组各24只大鼠。

1.2 药物、试剂和仪器 参附注射液，三九药业有限公司生产 （国药准字Z51020664）；红四氮唑 （TTC）染色剂（Sigma公司）；透射电子显微镜 （日立H-7650，河北联合大学电镜室）。

1.3 给药方法 参附注射液预处理高、中、低剂量组腹腔注射给药 （给药剂量：高剂量组20 mg/kg、中剂量组10 mg/kg、低剂量组5 mg/kg），每日1次，术前给药7 d，末次给药2 h内进行模型制作，术后停药。假手术组及模型组给予同容量生理盐水腹腔注射。

1.4 模型制备 术前禁食12 h，不禁水。以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，用烤灯维持体温37.0～37.5℃，体温由肛温探头连接多功能监测仪 （Space1ab，USA）监测。大脑中动脉阻断 （MCAO）再灌注模型制作参照曹勇军等改进的Longa线栓法［7-8］：大鼠取仰卧位，颈部正中行纵行切口 （长约25.0 mm），剥离右侧颈总动脉（CCA）及颈外动脉（ECA），结扎CCA近心端和ECA分叉部并反向拉直ECA，距CCA末端约5 mm处剪口，用做好的线栓 （直径0.26mm的鱼线，一端用酒精灯烧成光滑的圆头）插入颈内动脉 （ICA）约计 （18.5±0.5）mm，有轻微阻力即止，于ICA近心端结扎固定。2 h后，麻醉状态下抽出鱼线10mm行再灌注。假手术组大鼠实验步骤同上，但该组大鼠不发生大脑中动脉栓塞，故插入线栓的长度不超过9 mm。成功模型判定标准：大鼠左侧肢体瘫痪无力，站立不稳，提尾时左侧前爪抱爪。

1.5 神经功能行为学评分 再灌注24 h后观察各组大鼠神经系统功能缺失表现，并参照Zea Longa［7］5分法进行评分：无任何神经功能缺损为0分；左前爪不能伸直抱于胸前为1分；行走时身体以左侧为圆心转圈为2分；身体向左侧倾斜为3分；不能自发行走，意识丧失为4分。1～3分可进入后续试验，死亡、0分及4分者均剔除，随机补充，保证每组的数量不变。

1.6 大鼠脑组织梗死体积测定 缺血再灌注24 h后，各组大鼠随机选取6只，麻醉后快速断头取脑，冰箱中冷冻0.5 h后，切除低位脑干、嗅球及小脑后，从额极至枕极以2 mm间隔连续切取5个冠状脑片，并立即置于2%TTC磷酸缓冲液中，避光，37℃恒温孵育30 min后，用4%多聚甲醛液固定2 h。正常脑组织染色后呈红色，而梗死脑组织呈白色。数码相机拍摄图像，采用图像分析软件AUTOCAD 2000系统进行分析，用损伤对侧半球的面积减去损伤侧TTC染色正常的面积，即为梗死面积，将全部脑片梗死面积之和乘以脑片的厚度即得出梗死体积，并计算脑梗死体积占全脑的百分率［9］。

1.7 光学显微镜观察大鼠脑组织病理学改变 缺血再灌注24 h后，各组大鼠随机选取6只，麻醉状态下开胸暴露心脏，先后分别用150mL生理盐水及200mL 4%多聚甲醛磷酸缓冲液进行心脏灌流，断头取脑，甲醛固定，石蜡包埋，切片 （以前囟部位为中心沿冠状面向后连续切取3张，片厚3～5μm），HE染色，应用光学显微镜观察脑组织病理变化。

1.8 透射电镜观察大鼠脑组织海马区的超微结构改变 从各组随机选取缺血再灌注24 h大鼠各6只并麻醉，断头取出脑组织置于冰盒上，快速于右侧海马CA1区取脑组织（约0.5～1 mm3大小），用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液固定，经梯度丙酮脱水、Epon-812树脂包埋、切片、载网、染色后，置于电镜下观察脑组织的超微结构变化并留取图像。

2 结果

2.1 大鼠神经功能行为学评分 假手术组大鼠未显示出神经功能受损症状，模型组大鼠神经功能受损症状明显；较之于模型组，参附注射液预处理各组大鼠神经功能受损症状呈现不同程度的改善 （P＜0.01，或P＜0.05），高剂量组效果最好，具体见表1。

2.2 大鼠脑梗死体积测定结果 大脑中动脉血流被阻断后，大鼠脑组织缺血梗死，主要累及部位是基底节和皮层。肉眼观察，模型组大鼠梗死部位脑组织水肿，颜色苍白，比健侧体积增大，脑组织沟回变平、变浅。与假手术组比较，模型组大鼠脑组织体积增大，差异显著 （P＜0.05）；与模型组比较，参附注射液预处理组大鼠脑组织梗死体积有不同程度减少，差异显著 （P＜0.01，或P＜0.05），高剂量组效果最为明显，具体见表1。

表1 各组大鼠神经功能行为学评分及脑梗死体积比较（，n=6）

表1 各组大鼠神经功能行为学评分及脑梗死体积比较（，n=6）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.01，△△P＜0.05

组别 剂量/（mg·kg-1）神经功能行为学评分脑梗死体积/ % 0.00 0.00模型组 - 2.57±0.42* 24±0.05*参附注射液预处理组 20 1.66±0.43△ 11±0.01△10 1.79±0.68△△ 16±0.03△△5 2.03±0.55△△ 19±0.04假手术组-△△

2.3 光学显微镜观察结果 假手术组大鼠海马CA1区脑组织细胞层次分明，神经细胞形态结构完整，间质无水肿，胞浆丰富，胞核大而圆，核仁清晰 （图1A）；模型组大鼠梗死侧海马CA1区脑组织，神经元排列紊乱且数量显著减少，胞体肿胀变大，胞质呈空泡样疏松化，胞核固缩、深染，甚至溶解、消失 （图1B）。与模型组相比，参附注射液预处理各组大鼠梗死侧海马CA1区正常形态的神经元明显增多，仅有部分神经元发生变性，细胞间隙无明显变化，水肿减轻，胞浆轻度深染，核固缩，核仁消失者少见，上述变化在高剂量组体现最为明显 （图1C、D、E）。

图1 各组大鼠海马CA1区脑组织病理改变 （HE，×200）

2.4 透射电镜观察结果 假手术组大鼠脑组织神经元形态规则，结构清晰完整；胞核大而圆，核膜完整，染色质均匀分布在核内，电子透明度高；胞质内细胞器丰富，线粒体呈圆形或棒槌形，内嵴多且清晰，粗面内质网散在分布；未见凋亡细胞 （图2A）。模型组：神经元正常形态结构基本消失，外形不规则；胞核变形，核膜有缺损，核内异染色质增多，染色质聚集靠边；细胞器减少，结构模糊，线粒体嵴断裂、减少、甚至消失 （图2B）。参附注射液预处理组：与模型组对比，可见大鼠脑组织部分神经元变性；胞核皱缩不明显，染色质轻度聚集，核仁存在，水肿减轻；线粒体膜大部分完整或仅有轻微结构改变，肿胀减轻，内质网完整或仅轻度肿胀扩张。以高剂量组效果最为明显（图2C、D、E）。

图2 各组大鼠海马CA1区脑组织超微结构 （透射电镜，×18 000）

3 讨论

缺血性脑血管病由于脑血流供应障碍引起脑组织缺血、缺氧，导致局域性脑组织坏死或脑软化，其中脑缺血再灌注损伤是其重要的病理生理机制之一。近年来，有研究显示，中药对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，其抗损伤作用通过多个途径、多个作用靶点来实现［10］。

参附注射液由红参和黑附片提取而出，红参含有12种常见人参皂苷和10种稀有人参皂苷，附子提取物中主要含有6种乌头类生物碱［11］。有研究显示，红参中的主要有效成分人参皂苷，可以改善微循环，具有减少氧自由基、抑制炎症反应和阻止钙离子内流等多种作用［12］。亦有研究提示，人参皂苷在使Bc1-2表达增强的同时使Caspase-3表达减弱，由此起到抑制凋亡作用［13］。近年有学者研究发现，稀有人参皂苷Rg3对脑缺血具有神经保护作用［14］，且稀有人参皂苷的抗氧化能力和清除自由基能力比常见人参皂苷更强［15］。

本课题通过建立MCAO再灌注模型探讨参附注射液预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用，结果显示参附注射液可使缺血再灌注大鼠脑梗死面积明显缩小，神经功能缺失症状出现明显的改善，均提示该药对缺血再灌注脑组织具有保护作用。

光镜下，模型组大鼠梗死侧海马CA1区脑组织排列紊乱、间隙增宽，细胞肿胀明显，胞核固缩、深染，甚至溶解、消失。投射电镜观察超微结构，模型组梗死侧海马CA1区神经元外形不规则；胞核变形核内异染色质增多，染色质聚集靠边；细胞器减少，线粒体嵴断裂、减少、甚至消失；形成特征性的凋亡小体，参附注射液预处理组大鼠脑组织的改变与模型组对比，均明显减轻。研究结果证明参附注射液预处理具有减轻缺血再灌注脑组织神经功能损伤的作用。

［1］Zemke D，Smith JL，ReevesM J，et al.Ischemia and ischemic to1erance in the brain：an overview［J］.Neurotoxicology，2004，25（6）：895-904.

［2］吴红金，余少平，谢 芳.参附注射液的临床应用与机制研究［J］.中国自然医学杂志，2004，6（2）：120-123.

［3］Lim JH，Wen TC，Metsuda S，etal.Protection of ischemic hip-pocampa1neurons by ginsenoside Rb1，amain ingredient of gin-seng root［J］.NeurosciRes，1997，28（3）：191-200.

［4］Wen TC，Yoshimura H，Matsuda S，et al.Ginseng root prevents 1earning disabi1ity and neurona11oss in gerbi1swith 5 minute forebrain ischemia［J］.Acta Neuropathol，1996，91（1）：15-22.

［5］Zhang Y G，Liu TP.Inf1uence ofginsenosides Rb1and Rg1on reversib1e foca1brain ischemia in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，1996，17（1）：44-48.

［6］陈嘉峰，宗瑞义，陈声武.人参皂甙对急性脑缺血的影响［J］.中华医学杂志，1990，70（10）：584.

［7］Chiang T，Messing R O，Chou W H，et al.Mouse mode1 of midd1e cerebra1 artery occ1usion［J］.J Vis Exp，2011，13（48）：2761-2763.

［8］张 乾，毛善平，李 涛，等.构建大脑中动脉阻塞脑缺血模型大鼠的类型分析［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（24）：4391-4394.

［9］刘 斌，蔡梅芝，李爱华，等.参芎化瘀胶囊对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：229-232.

［10］许迎春.中药抗脑缺血再灌注损伤的实验研究［J］.吉林中医药，2009，29（10）：892-894.

［11］杨瑞杰.参附注射液化学成分研究［D］.长春：吉林大学，2012：6.

［12］赵秋振，刘玉利，张 辉，等.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注海马神经元BaxmRNA表达的影响［J］.时珍国医国药，2011，22（2）：435-436.

［13］吕风亚.人参总皂甙对大鼠脑缺血再灌注后MDA、SOD及细胞凋亡的影响［J］.脑与神经疾病杂志，2005，13（3）：189-191.

［14］Lee JH，Jeong SM，Kim JH，et al.Characteristics of ginsenoside Rg3-Mediated brain Na+current inhibition［J］.Mol Pharmacol，2005，68（4）：1114-1126.

［15］Choi K T.Botanica1characteristics，pharmaco1ogica1effects and medicina1 components of Korean Panax ginseng C AMeyer［J］. Acta Pharmacol Sin，2008，29（9）：1109-1118.

R285.5

B

1001-1528（2015）08-1818-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.041

2014-10-11

河北省科学技术研究与发展项目 （132777218）；唐山市科学技术研究与发展项目 （12130268b）

李爱华 （1977—），女，硕士，讲师/主治医师，主要从事脑血管病基础研究与临床研究。Te1：15127577896，E-mai1：865906446@qq.com

*通信作者：李 倩 （1977—），女，讲师，从事脑血管病基础研究。Te1：15532585160，E-mai1：340154235@qq.com