复方丹参滴丸对2型糖尿病大鼠模型胰岛β细胞功能的影响
2015-01-18罗佐杰秦映芬
周 嘉， 寻 英， 黄 松， 罗佐杰， 秦映芬*
（1.广西医科大学第一附属医院内分泌科，广西南宁530021；2.浏阳市人民医院，湖南浏阳410300）
复方丹参滴丸对2型糖尿病大鼠模型胰岛β细胞功能的影响
周 嘉1， 寻 英2， 黄 松1， 罗佐杰1， 秦映芬1*
（1.广西医科大学第一附属医院内分泌科，广西南宁530021；2.浏阳市人民医院，湖南浏阳410300）
目的观察复方丹参滴丸对2型糖尿病SD大鼠胰岛β细胞氧化应激与凋亡的影响。方法建立2型糖尿病大鼠模型，复方丹参滴丸干预12周后，检测FBG、TC、TG及Insu1in，胰腺匀浆检测MDA、SOD、GSH-Px，胰腺Masson染色，免疫组化检测Insu1in、α-SMA、CD31的表达，原位末端标记法 （Tune1法）计算胰岛β细胞凋亡率。结果复方丹参滴丸干预组MDA、SOD、GSH-Px含有量，α-SMA、CD31、Insu1in表达水平，β细胞凋亡及糖、脂代谢均有不同程度改善 （P＜0.05）。结论复方丹参滴丸可抑制胰岛氧化应激，减轻胰岛纤维化、改善胰岛微循环，减少β细胞凋亡，改善胰岛功能。
复方丹参滴丸；2型糖尿病；氧化应激；凋亡
复方丹参滴丸作为传统中药，其有效部分为水溶性的丹参素和脂溶性的丹参酮，均是良好的氧自由基清除剂，被广泛用于冠心病和糖尿病微血管并发症的预防和治疗。胰岛β细胞是体内唯一易受到氧化损伤和极易凋亡的细胞。近年研究结果显示，复方丹参滴丸可降低糖尿病动物及患者的血糖［1-3］，推测其降血糖作用可能与潜在抗氧化作用有关，从而对胰岛β细胞具有保护作用。因此，本研究拟观察复方丹参滴丸对2型糖尿病SD大鼠模型胰岛β细胞氧化应激与凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂 6～8周龄雄性健康SD大鼠40只，体质量180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供（合格证号SCXK桂2009-0002）；普通标准饲料、高糖高脂饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；复方丹参滴丸 （天津天士力制药股份有限公司，批号110105）；胰岛素放射免疫分析药盒 （北京北方生物技术研究所）；超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Ma1ona1dehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（G1utathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒 （南京建成生物工程有限公司）；胰岛素抗体 （美国santa cruz biotechno1ogy公司）；CD31抗体（ABBIOTEC公司）；α-SMA抗体 （武汉博士德生物工程有限公司）；Tune1试剂盒（德国Roche公司）。
1.2 方法 40只SD大鼠适应性喂养1周后，随机分组，其中10只为正常对照组给予普通标准饲料，其余30只给予高糖高脂饲养8周后，一次性腹腔注射小剂量现配的2%STZ溶液 （20 mg/kg），72 h后采尾部末梢血，优越血糖仪（ACCU CHEK Advantage，瑞士罗氏诊断公司）测定随机血糖（random b1ood g1ucose，RBG），以RBG≥16.7 mmo1/L为造模成功，1周后血糖稳定，RBG≥16.7 mmo1/L者随机进入糖尿病模型组 （12只）、复方丹参滴丸组 （12只）。复方丹参滴丸组给予复方丹参滴丸180 mg/kg灌胃干预12周，同时其余2组予等量生理盐水灌胃12周。实验过程中6只大鼠死亡，未纳入最后统计。
1.3 观察指标
1.3.1 生化指标测定 葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖（FBG），血清甘油三酯 （TG）、总胆固醇 （TC）采用Beckman X20全自动生化分析仪测定；放射免疫分析法测定空腹胰岛素（FINS），计算HOMA-IR（胰岛素抵抗指数）=FINS×FBG/22.5，ISI（胰岛素敏感指数）=1/ FINS×FBG。
1.3.2 胰腺SOD、MDA、GSH-Px测定 各组灌胃干预12周取胰腺组织匀浆吸取上清液，按试剂盒说明书操作，分光光度仪测各组OD值，并根据公式计算SOD、MDA、GSH-Px含有量。
1.3.3 胰腺Masson染色 根据Masson三色染色法染色，常规光镜下观察胰岛及其周围组织纤维增生程度，结果判定：胶原纤维呈绿色、肌纤维及红细胞呈红色。
1.3.4 免疫组织化学检测 胰岛素 （Insu1in）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth musc1e actin，α-SMA）、CD31 SP法检测，细胞胞浆见棕黄色颗粒聚集为阳性信号。每张切片随机取5个视野（40×）拍照，采用Image-Pro P1us 6.0病理图像软件分析系统，测定各组光密度值，分析胰腺Insu1in、α-SMA、CD31的表达水平。
1.3.5 Tune1法计算胰岛β细胞凋亡率 按照试剂盒说明操作，正常细胞胞核呈蓝色，凋亡细胞胞核呈棕褐色。采用Image-Pro P1us 6.0病理图像软件分析系统，进行半定量分析。每张切片计数5个不同视野中阳性细胞的比例判断细胞凋亡情况。细胞凋亡率 （%） =凋亡细胞数目/（凋亡细胞数目+正常细胞数目）×100%。
1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，符合正态分布的计量资料用均数±标准差 （）表示，多组间比较采用单因素方差分析，相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 复方丹参滴丸对糖脂代谢与胰腺氧化应激水平的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠体质量明显下降，血清FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR水平显著增高，ISI显著降低；同时，胰腺MDA含有量明显升高，SOD、GSHPX含有量显著降低 （P＜0.05）。与模型组相比，复方丹参滴丸组血清FBG、TC、TG、FINS、HOMA-IR均有不同程度下降，体质量及ISI升高，胰腺SOD、GSH-PX含有量均表现为不同程度升高，MDA含有量明显下降 （P＜0.05）（见表1、2）。
表1 各组大鼠FBG、TC、TG、FINS、ISI、IR比较（）
表1 各组大鼠FBG、TC、TG、FINS、ISI、IR比较（）
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05
ISI HOMA-IR正常对照组组别 FBG/（mmo1·L-1） TC/（mmo1·L-1） TG/（mmo1·L-1） FINS/（mU·L-1）4.82±0.51 1.69±0.34 1.34±0.34 8.56±0.40 -3.72±0.13 1.84±0.23模型组 9.69±0.64* 2.92±0.32* 2.78±0.33* 10.39±0.43* -4.61±0.07* 4.47±0.32*复方丹参滴丸组 8.26±0.71*● 2.01±0.38*● 2.06±0.29*● 9.85±0.21*● -4.40±0.08*● 3.61±0.29*●
表2 各组大鼠胰腺组织氧化应激情况 （）
表2 各组大鼠胰腺组织氧化应激情况 （）
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05
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2.2 复方丹参滴丸对胰岛CD31、α-SMA与Insu1in蛋白表达的影响 与正常对照组相比，模型组CD31、Insu1in蛋白表达明显下降，α-SMA显著增加，CD31表达量与Insu1in表达量呈正相关，α-SMA表达量与Insu1in表达量呈负相关（P＜0.05）。与模型组相比，复方丹参滴丸组CD31、Insu-1in蛋白表达明显恢复，α-SMA表达明显降低 （P＜0.05）（见表3）。胰腺组织SOD、GSH-Px含量与胰岛CD31、Insu1in蛋白表达量呈正相关，与α-SMA表达量呈负相关；MDA含量与胰岛CD31、Insu1in蛋白表达量呈负相关，与α-SMA表达量呈正相关（P＜0.05）。结合Masson染色结果 （染色模型组＞复方丹参滴丸组＞正常对照组），提示糖尿病大鼠胰岛内及周围组织出现不同程度纤维化改变，使得胰岛β细胞结构与功能受损 （见图1）。
表3 各组大鼠胰腺组织免疫组化染色情况 （）
表3 各组大鼠胰腺组织免疫组化染色情况 （）
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，●P＜0.05
-SMA正常对照组组别 Insu1in CD31 α 10.65±0.99 6.65±0.84 3.51±0.53模型组 6.24±0.36* 2.98±0.41* 9.45±1.07*复方丹参滴丸组 7.46±0.70*●4.96±0.46*● 7.24±0.71*●
2.3 复方丹参滴丸干预对胰岛β细胞凋亡的影响 模型组凋亡率显著高于其他两组，复方丹参滴丸组凋亡情况明显改善（P＜0.05）（见图2）。胰腺组织SOD、GSH-Px含有量与胰岛细胞凋亡率呈负相关，MDA含有量与胰岛细胞凋亡率呈正相关 （P＜0.05）。
图1 各组大鼠胰腺M asson染色情况（40×）
3 讨论
复方丹参滴丸是根据中医传统理论和现代科学技术相结合而成的复合制剂，主要由丹参、三七、冰片组成。药理及药效学的研究证实，具有活血化瘀、消肿、凉血、止血功能，可扩张冠脉血管、增加冠脉血流量、防治心肌缺血，对动脉粥样硬化等大血管病变有很好的效果；同时也可通过抗氧化、抗血小板活化和聚集、改善脂质代谢、保护血管内皮等多靶点作用，对糖尿病微循环障碍性疾病起到治疗效果。近年研究发现复方丹参滴丸在控制血糖方面也有一定的作用，可能与其改善微循环的作用有关［2］。陈频等［3］报道复方丹参滴丸干预可显著改善胰岛素抵抗大鼠的糖脂代谢水平。而复方丹参滴丸对胰岛β细胞影响的报道尚少。
图2 各组大鼠胰岛β细胞凋亡情况比较 （）
由于胰岛细胞本身抗氧化能力较低，极易受氧化损伤，高血糖可通过诱导蛋白激酶C依赖的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸活化等途径刺激胰岛β细胞产生过多的活性氧簇分子。因此，氧化应激已被证实是诱导胰岛β细胞凋亡和抑制胰岛素分泌的重要因素，有效的抗氧化治疗可减轻氧化应激，保护胰岛β细胞功能，减少其凋亡。本研究结果表明，与正常对照组相比，2型糖尿病SD大鼠模型组存在高血糖、高血脂等代谢紊乱以及胰岛素抵抗的状态，同时，胰腺MDA含有量明显升高，SOD、GSH-Px含有量显著降低，二者失衡提示胰腺组织处于明显的氧化应激状态。而且，2型糖尿病SD大鼠模型组胰岛β细胞凋亡率显著高于正常对照组，胰腺组织SOD、GSH-Px含有量与胰岛细胞凋亡率呈负相关，MDA含有量与胰岛细胞凋亡率呈正相关。本研究结果亦表明，给予复方丹参滴丸干预后，2型糖尿病SD大鼠模型组的糖脂代谢、胰岛素抵抗及氧化应激得到明显改善，胰岛细胞凋亡率减少。说明复方丹参滴丸可通过抗氧化应激，减少胰岛β细胞凋亡，保护胰岛β细胞功能。同样，任宏强等［4］报道，复方丹参滴丸干预的大鼠急性心肌缺血再灌注模型，心肌细胞凋亡显著减少，凋亡相关蛋白Fas、Fas-L和p53mRNA的表达水平明显下调。
胰岛具有丰富的微循环系统，是维持胰岛结构与功能的基础，而胰岛血管内皮细胞是维持胰岛生理功能的重要细胞之一。糖耐量异常或糖尿病动物模型中均存在不同程度的胰岛微循环调节异常：在肥胖或糖尿病前期，胰岛处于高灌注状态，进而引起胰岛微血管高压及胰岛内皮细胞损伤，内皮功能损伤又进一步导致胰岛血流调节异常，最终使得胰岛微循环灌注不足，胰岛功能失代偿，提示胰岛微循环调节障碍可能参与了糖尿病胰岛功能衰竭的发生发展过程［5］。研究显示通过改善胰岛微循环对胰岛功能具有保护效应［6-7］。考虑到复方丹参滴丸具有活血化瘀的功效，且陈岩等［8］报道，丹参干预后的家兔心肌梗死模型CD31表达明显增加，梗死及其周围区新生毛细血管数量增加、供血改善，梗死面积减少。因此，本研究采用CD31作为内皮细胞标记评价胰岛内微血管结构的数量，发现复方丹参滴丸干预后能促进糖尿病大鼠胰岛内微血管的生成，胰岛供血明显改善，β细胞功能较前明显恢复，且胰腺组织SOD、GSH-Px含有量与胰岛CD31、Insu1in蛋白表达量呈正相关，MDA含有量与胰岛CD31、Insu1in蛋白表达量呈负相关，提示可能与其良好的抗氧化活性相关。
进一步的研究提示胰岛纤维化是糖尿病进程中的重要病理改变。胰岛纤维化可破坏胰岛的正常组织结构并导致胰岛功能恶化、β细胞数量减少、胰岛素分泌降低。现有的研究认为氧化应激是引起胰岛纤维化的四大潜在因素之一，胰岛内氧化应激的改善甚至是维护胰岛形态和功能稳定的最强标志［9-10］。胰腺星状细胞（pancreatic ste11ate ce11，PSC）是胰腺纤维化起始和发展的中心环节，它与肝星状细胞在诸多方面存在相似之处，在各自纤维化疾病中都发挥着重要作用。当胰腺受损时，PSC被活化，由原来的储脂细胞转变为肌成纤维样细胞，开始表达α-SMA，合成细胞外基质，成为病理状态下胰腺纤维化的主要功能细胞。因此，α-SMA是活化PSC的特异性表达标志［11］。Hsu等［12］实验发现，丹参明显抑制肝脏α-SMA的表达产生，对肝纤维化有抑制作用。类似的是，本研究结果提示2型糖尿病SD大鼠胰岛的α-SMA显著增加，与Insu1in表达量呈负相关，结合Masson染色结果（染色模型组＞复方丹参滴丸组＞正常对照组），提示糖尿病大鼠胰岛内及周围组织出现不同程度纤维化改变，使得胰岛β细胞结构与功能受损。给予复方丹参滴丸干预后，α-SMA表达明显降低，Insu1in蛋白表达增加，胰岛纤维化程度较糖尿病组明显改善。
近年来胰岛局部微环境的重要性逐步得到研究者的重视。胰岛微环境包括胰岛内部微血管结构的数量和功能、胰岛氧化应激程度、胰岛局部存在的旁分泌系统等，对胰岛细胞增殖、凋亡、胰岛素分泌功能和胰岛素敏感性具有较大的影响［13-14］。作为传统中成药的复方丹参滴丸，其在临床的应用不断被开发，而本研究结果提示复方丹参滴丸可通过抑制胰岛氧化应激，减轻胰岛纤维化、改善胰岛微循环，减少β细胞凋亡，从而改善胰岛功能，值得更多的关注及进一步研究。
［1］李佑生，王文健，马宇滢，等.复方丹参滴丸防治大鼠早期糖尿病肾脏损害的研究［J］.中成药，2007，29（1）：40-44.
［2］王红团，吴多荣.复方丹参滴丸对2型糖尿病患者血糖和血液流变学的影响［J］.山东医药，2008，48（19）：139.
［3］陈 频，徐向前，史道华.复方丹参滴丸对胰岛素抵抗大鼠糖脂代谢的影响［J］.中成药，2008，30（4）：489-493.
［4］任宏强，赵 利，王 忠，等.复方丹参滴丸对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响［J］.中国动脉硬化杂志，2013，21（12）：1084-1088.
［5］李 新，袁 莉.胰岛微循环与胰岛功能［J］.国际内科学杂志，2008，35（12）：709-712.
［6］Huang Z，Jansson L，Sjöho1m A.Pancreatic is1et b1ood f1ow is se1ective1y enhanced by captopri，1 irbesartan and pravastatin，and suppressed by pa1mitate［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，346（1）：26-32.
［7］Huang Z，Jansson L，Sjöho1m A.Vasoactive drugs enhance pancreatic is1et b1ood f1ow，augment insu1in secretion and improved g1ucose to1erance in fema1e rats［J］.Clin Sci（Lond），2007，112（1）：69-76
［8］陈 岩，杨关林，张 哲，等.丹参注射液对心肌梗死后梗死区及周围区血管再生的影响［J］.中华中医药学刊，2009，27（5）：975-977.
［9］Homo-De1arche F，Ca1derari S，Irminger J C，et al.Is1et inf1ammation and fibrosis in a spontaneousmode1of type 2 diabetes，the GK rat［J］.Diabetes，2006，55（6）：1625-1633.
［10］Tike11is C，Wookey P J，Candido R，et al.Improved is1etmorpho1ogy after b1ockade of the renin-angiotensin system in the ZDF rat［J］.Diabetes，2004，53（4）：989-997.
［11］Bachem M G，Zhou S，Buck K，et al.Pancreatic ste11ate ce11sro1e in pancreas cancer［J］.Langenbecks Arch Surg，2008，393（6）：891-900.
［12］Hsu Y C，Lin Y L，Chiu Y T，et al.Antifibrotic effects of Salvia miltiorrhiza on dimethy1nitrosamine-intoxicated rats［J］.J Biomed Sci，2005，12（1）：185-195.
［13］Chu K Y，Leung P S.Angiotensin II in type 2 diabetesme11itus［J］.Curr Protein Pept Sci，2009，10（1）：75-84.
［14］Bindom SM，Lazartigues E.The sweeter side of ACE2：Physio-1ogica1evidence for a ro1e in diabetes［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，302（2）：193-202.
R285.5
B
1001-1528（2015）08-1807-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.038
2014-10-12
广西自然科学基金资助项目 （桂科青0832029）；广西中医药民族医药资助项目 （GZZC14-42）
周 嘉 （1975—），女，副主任医师，博士，从事内分泌代谢病研究。Te1：（0771）5356517，E-mai1：ab0851@163.com
寻 英（1990—），女，住院医师，硕士，从事内分泌代谢病研究。Te1：（0731）83605752，E-mai1：inxun@foxmai1.com
*通信作者：秦映芬 （1968—），女，主任医师，博士，从事内分泌代谢病研究。Te1：（0771）5356517，E-mai1：yingfenq@126.com
