蛋白质电泳指纹图谱在各产地贝母亲缘关系研究中的应用

吴 浩， 彭 昕， 张煜炯， 王忠华

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波315100；2.浙江万里学院，浙江宁波315100）

蛋白质电泳指纹图谱在各产地贝母亲缘关系研究中的应用

吴 浩1， 彭 昕1， 张煜炯1， 王忠华2*

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波315100；2.浙江万里学院，浙江宁波315100）

目的研究浙贝母和其他产地贝母品种的亲缘关系。方法采用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹技术，对具有代表性的7个品种 （系）浙贝及东贝、皖贝、川贝这3种近缘药用贝母 （共30份个体）进行分析。结果10种贝母的基因多样性指数为0.333 4，Shannon信息指数为0.490 2，多态位点百分率 （PPB）为85.71%。结论浙贝母的宽叶、轮叶、狭叶、梅园和新梅园品种间的相似性系数在0.772 2～0.933 2之间，其中宽叶种与轮叶贝母遗传距离最小，三籽和多籽与其他浙贝品种 （系）亲缘关系较远，而与东贝母的遗传相似性高于上述5个浙贝母品种 （系），并且皖贝与川贝之间亲缘关系较近，聚为另一类。

贝母；蛋白质电泳指纹图谱；遗传多样性；亲缘关系；

中药贝母为百合科贝母属多种植物的干燥鳞茎，具有化痰止咳，清热润肺之功效。《中国药典》2010年版将其分为浙贝母Fritillaria thunbergii、川贝母Fritillaria cirrhosa、平贝母Fritillaria ussuriensis、伊贝母Fritillaria pallidiflora、湖北贝母Fritillaria hupehensis5大类。其中，浙贝母是我国传统的大宗中药材，被列为 “浙八味”之首，主要来自人工栽培，原产于浙江省宁波市象山县，目前其栽培基地主要分布于鄞州、缙云、磐安等地，栽培品种 （系）有狭叶、宽叶、三芽 （小三籽）、多芽（多籽种）、轮叶、梅园、新梅园等。而且，浙贝母各产区的栽培技术习惯也不同，许多地方的品种多为自然变异，同时由于长期分散种植，基源植物的种质遗传结构和来源尚不明确［1-2］。本课题组前期采用ISSR分子标记技术对磐安产的浙贝母品种进行种质资源鉴定，结果发现相同浙贝母品种的不同个体之间出现了较大的遗传分化，表明目前该植物种质混杂现象比较严重［3］。另外，还比较了金华磐安、宁波章水和江苏南通5个浙贝母品种的生理生化特性，结果显示，产地和品种对浙贝母的多种酶活性和叶绿素含有量均有较明显影响［4］。药源植物明确，品系纯正是保证药材道地性的基础，而浙贝母来源品种的混杂将严重影响其疗效和安全性。因此，对该植物种质资源的鉴定、种质遗传结构和亲缘关系方面的研究工作是指导浙贝母品种选育、GAP标准化生产以及保证临床用药安全稳定性的必要理论基础。

中药电泳指纹图谱是将分子生物学和指纹图谱的原理应用于中药品种分类、鉴定以及质量控制研究的技术［5］。其中，蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹技术（Pro-PAGE）是该图谱中易于规范化和标准化的方法，并具有所需样品量少、实验时间短、结果稳定性好、重复性高、技术简单、费用低廉等优点，在中药栽培品种资源考察、种内遗传多样性分析、优良品种选育以及药材采收期判断等方面［4-5］具有较高的推广应用价值。近年来，人们报道了ISSR［6］、RAPD［7］、AFLP［8］等DNA多态性技术以及化学指纹图谱技术［9］用于浙贝母品种内或与其他贝母之间遗传多样性的分析，然而，采用蛋白电泳指纹图谱对其多态性的研究尚未见报道。本实验采用Pro-PAGE技术，对浙贝（7个不同栽培品种和品系）和东贝、皖贝、川贝3种近缘药用种进行群体遗传多样性分析，为其品种选育及GAP规范化生产的指导奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及主要仪器 本实验所有试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。Ge1Doc XR+凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad公司）；高速冷冻离心机（杭州纳德科学仪器公司）；DYY-6C稳流稳压电泳仪、DYCZ-24EN双垂直电泳槽（北京市六一仪器厂）。

1.2 样品采集 本实验所用的贝母鳞茎分别采自浙江省宁波市鄞州区章水镇浙贝母栽培示范基地及金华市磐安县等地，品种 （系）均经浙江万里学院王忠华教授鉴定，见表1。

表1 贝母鳞茎的采样信息及其性状Tab.1 Sam p le information and characteristics of Fritillaria cultivars

1.3 蛋白质提取 将新鲜贝母鳞茎洗净晾干，取2 g，加入0.1 mo1/L，pH为6.4的磷酸缓冲液（PBS）1 mL，于冰浴中研磨，离心 （12 000 r/min）20 min后取上清液，加入等体积上样缓冲液（含pH为6.8，1 mo1/L的10%Tris-HC1缓冲液、30%甘油、2%SDS、8%β-巯基乙醇，0.1%溴酚蓝），100℃下煮沸5 min后，4℃下贮藏备用。

1.4 电泳 采用SDS-PAGE法，分离胶和浓缩胶的浓度为别为15%和5%，垂直平板电泳，加样量为30 μL，电极缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲液（含1‰SDS），起始电压80 V，在指示剂进入分离胶后改为120 V，恒压电泳6 h，待指示剂 （溴酚兰）至胶板下沿1 cm左右时停止电泳，小心取出胶板。

1.5 染色及脱色 将胶板浸于考马斯亮蓝染色液（含0.1%考马斯亮蓝G250、17%硫酸铵、2.4%磷酸、34%甲醇）中，37℃温浴下染色过夜后，蒸馏水漂洗3次，再放入脱色液 （含7.5%冰乙酸、10%甲醇、0.5 mo1/L NaC1水溶液），摇床上漂洗4 h，直至谱带背景清晰。

1.6 指纹图谱分析 对供试样品水溶性蛋白电泳带总数和多态性带数目进行统计，每个样品电泳迁移率一致位点按无带或模糊带记为0，有强带和弱带记为1，得到原始数据矩阵。然后，用NTSYS 2.10e软件中的非加权配对算术平均法（UPGMA）计算遗传相似性系数，并构建聚类图，再用POPGENE 3.2软件计算等位基因数（na）、有效等位基因数 （ne）、Shannon多样性指数 （I）、基因多样性指数 （H）、总基因多样度 （Ht）、种内基因多样度 （Hs）、基因分化系数 （Gst），并依据公式Nm=0.5（1-Gst）/Gst计算基因流（Nm），用于分析种间和种内的遗传变异水平。

2 结果

2.1 10种贝母的蛋白电泳指纹图谱 蛋白质SDSPAGE谱带总体上呈现出相似性，共有条带成像清楚，体现出品种 （系）的一致性，但不同品种（系）间的条带数量及其强弱差异也很明显，能检测到很丰富的多态性，也可作为聚类分析的参数，见图1。经统计，各品种 （系）总蛋白条带在15～29条之间，30个样品共得到740条扩增带，其中多态性条带比率为85.71%。

图1 10种贝母的蛋白质SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE spectrogram s of 10 Fritillaria cultivars

2.2 遗传相似性及多样性分析 对10种贝母进行了遗传相似性分析，结果见表2。由表可知，浙贝母的宽叶、轮叶、狭叶、梅园和新梅园5个品种（系）间的相似性较高，相似性系数在0.772 2～0.933 2之间。其中，宽叶种与轮叶贝母品系间的相似度最高，遗传距离最小，而浙贝母的另2个品系 （三籽和多籽）与东贝母的遗传相似性高于上述5个浙贝母品种 （系），并且浙贝、皖贝、东贝、川贝4个种间的相似系数变化范围在0.420 0～0.830 3之间，变化幅度较大，表明不同贝母品种间存在较丰富的遗传多样性，其中浙贝与川贝的相似性最低，亲缘关系较远，而皖贝与川贝的相似性最高，亲缘关系较近。

10种贝母的遗传指数见表3，可知整体总基因多样性（Ht）、种内遗传多样性（Hs）、基因分化系数（Gst）分别为0.333 4、0.016 2、0.951 4。结果表明，95.14%的遗传分化存在于品种 （系）间，而种间基因交流非常有限，仅为0.025 5。

表2 10种贝母间遗传相似性指数及遗传距离Tab.2 Nei's genetic sim ilarity indexes and genetic distances am ong 10 cultivars of Fritillaria

表3 10种贝母遗传指数Tab.3 Genetic indexesw ithin 10 cultivars of Fritillaria

2.3 聚类分析 利用NTSYS 2.10e软件进行聚类分析，得到UPGMA系统树，见图2。由图可知，浙贝母7个品种 （系）中的宽叶与轮叶亲缘关系最近，首先聚为一类，再与狭叶、梅园和新梅园3个品种 （系）聚为一支，而三籽和多籽2个浙贝品系的亲缘关系相对较远，与东贝母聚为一支。并且，在不同贝母种之间，皖贝与川贝亲缘关系较近，从地理位置距离来看，原产地相对较近的浙贝和东贝表现出较近的亲缘关系，聚为一大类。

图2 10个贝母Nei's遗传距离的UPGMA聚类图Fig.2 UPGM A dendrogram of 10 cultivars of Fritillaria based on Nei's genetic distances

3 讨论

种质资源多态性及亲缘关系分析对阐明物种的起源、分化、遗传变异及品种鉴定有着重要意义，可为育种和资源的合理利用提供科学依据［10-11］。近年来，用于蛋白质或同工酶多态性检测的电泳技术已被广泛用于品种鉴定［12］及遗传多样性分析［13］，由于总蛋白几乎不受环境因素的影响，而且多态性高［14］，已被广泛用于种质资源遗传多样性的分析及品种鉴定。

浙贝母繁殖系数相对较低，其产区分散，各产区栽培习惯也不同，存在许多自然变异的地方栽培品种，其药源植物的种质遗传结构和来源尚不明确，因此采用分子手段分析浙贝母道地性药材的种质遗传结构和遗传多样性，是指导其品种选育和GAP标准化生产的必要科学依据。刘晓贤［6］应用ISSR技术对浙贝母、东贝母、川贝母、安徽贝母等进行了遗传多样性分析，结果发现所有品种间的总遗传多样性较高，但浙贝母个别居群基因的多样性很低。聚类分析显示，多籽浙贝形成独立一支，东贝母与浙贝母分化明显，安徽贝母与川贝母形成一大支不同的贝母品种，表明浙贝母各品种和居群间的基因交流程度非常有限。基于RAPD技术的遗传多样性分析［7］显示，多籽浙贝与狭叶、宽叶和岭下贝母3个品种 （系）亲缘关系相对较远，而浙贝母与东贝母的亲缘关系较近，与本实验的结论基本一致。而徐金中等［8］应用AFLP技术对具有代表性的6个浙贝母居群进行了分析，发现其居群间的多样性水平明显低于居群内，同时居群间存在较为明显的基因交流，推测可能是因为该研究重点考察不同地理位置对浙贝母基因多样性水平的影响。另外，同一产区栽培的浙贝母可能有本地种或多个引进品种，例如宁波市鄞州区的浙贝母栽培种有狭叶、宽叶、轮叶、三籽等多个品种 （系），因此同一地理居群内丰富的遗传多样性有很大一部分可能来源于同居群中不同品种 （系）浙贝母的基因差异。本实验显示，浙贝母和东贝母表现出较近的亲缘关系，聚为一大类，而皖贝与川贝之间亲缘关系较近，聚为另一大类；浙贝母7个品种 （系）中的宽叶与轮叶亲缘关系最近，而三籽和多籽2个浙贝品系亲缘关系相对较远；10种贝母和7品种（系）浙贝母的总基因多样性均较高，分别为0.333 4和0.237 9，并且遗传分化主要存在于种间，各品种 （系）间基因交流非常有限。

综上所述，贝母的总基因多样性较高，而且浙贝母各品种 （系）间的形态和遗传差异都较为明显，基因交流也很有限，推测其遗传分化可能是人为选择压力和基因交流障碍引起的。长期的无性繁殖虽然保证了同一品种药材品质的一致性，有利于实施药材标准化生产，但各品种 （系）间的基因交流非常稀少，不利于优良品种的选育。因此，在浙贝母的生产过程中，既要控制不同品种栽培群体的传播，以避免种质混杂，又要尽可能地减少自交衰退所导致的遗传结构破坏，并注意引进优质种源进行杂交育种，以增加后代的杂合度，尤其是三籽、多籽等在遗传结构上与其它浙贝母品种亲缘关系较远的品种。

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App lication of protein fingerprints on the genetic relationship am ong Fritillaria species cultivated in different grow ing areas

WU Hao1， PENG Xin1， ZHANG Yu-jiong1， WANG Zhong-hua2*

（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

AIMTo study the genetic re1ationship among the various cu1tivars of Fritillaria Linn cu1tivated in Zhejiang Province and other growing areas.METHODSThirty individua1s，inc1uding 7 representationa1cu1tivars of Fritillaria thunbergii，togetherwith F.cirrhosa，F.anhuiensis and F.thunbergii var.chekiangensis were investigated by protein fingerprintsmethod.RESULTSItwas revea1ed that0.333 4 was genetic diversity index，0.490 2 was Shannon information index，and 85.71%was percentage of po1ymorphic 1oci（PPB）.CONCLUSIONIt indicates that the simi1arity coefficients among broad-1eaf，whee1-1eaf，narrow-1eaf，Mei-yuan and new Mei-yuan cu1tivars fa11within 0.772 2-0.933 2，especia11y c1oser in genetic distance between broad-1eaf and whee1-1eaf cu1-tivars，whi1e three-seed and severa1-seed cu1tivars have far re1ationsipswith F.thunbergii，butnear to F.thunbergii var.chekiangensis and F.cirrhosa.In addition，the cu1tivars of F.cirrhosa and F.anhuiensis are c1ustered into another group bacause of c1ose genetic re1atioship.

Fritillaria Linn；protein fingerprints；genetic diversity；genetic re1ationship

R282.5

A

1001-1528（2015）08-1757-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.027

2014-09-12

浙江省育种专项项目 （2012C12912）；宁波市农业攻关重点资助项目 （2012C10036）；浙江医药高等专科学校校级科研项目（ZPCSR2012010）

吴 浩（1985—），女，实验师，研究方向为分子生物学。E-mai1：11wuhao@163.com

*通信作者：王忠华 （1972—），男，教授，硕士生导师，研究方向为药用植物分子改良。E-mai1：wang1972@zwu.edu.cn