强壮灵合剂对小鼠免疫功能的影响
2015-01-17于皎凌姜素云窦德强王绍杰
李 娜, 于皎凌, 姜素云*, 窦德强, 王绍杰
(1.大连市食品药品检验所,辽宁大连116021;2.辽宁中医药大学,辽宁大连116000;3.大连市儿童医院,辽宁大连116001)
强壮灵合剂对小鼠免疫功能的影响
李 娜1,2, 于皎凌1, 姜素云1*, 窦德强2*, 王绍杰3
(1.大连市食品药品检验所,辽宁大连116021;2.辽宁中医药大学,辽宁大连116000;3.大连市儿童医院,辽宁大连116001)
目的研究强壮灵合剂对小鼠免疫功能的影响。方法采用氢化可的松制备小鼠免疫抑制模型,连续灌胃给予不同剂量的强壮灵合剂30 d,测定免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬指数,胸腺、脾脏指数及迟发型过敏反应水平,观察强壮灵合剂对免疫抑制小鼠免疫功能的影响;给正常小鼠连续灌胃给予不同剂量的强壮灵合剂15 d,测定小鼠胸腺、脾脏指数、血清溶血素水平,观察强壮灵合剂对正常小鼠免疫功能的影响。结果与模型组相比,强壮灵合剂能显著提高免疫抑制小鼠的单核巨噬细胞吞噬功能、迟发型超敏反应水平;显著提高正常小鼠的溶血素抗体生成能力;能提高免疫抑制小鼠和正常小鼠的免疫器官指数。结论强壮灵合剂具有调节增强免疫功能,对小鼠特异性免疫和非特异性免疫均有一定的增强作用。
强壮灵合剂;免疫功能;巨噬细胞
强壮灵合剂以经方玉屏风散为基础添加补肺健脾益肾的黄精、板蓝根等药物而成,具有补肺固表,健脾益肾,提高机体免疫等功能。临床上用于体虚多汗,易患感冒,倦怠乏力,便干,食欲不振等病症,疗效显著[1-3]。黄芪是该复方的君药,研究表明黄芪有调节免疫功能,可以对抗氢化可的松引起的免疫抑制[4-7]。本实验观察了强壮灵合剂及君药黄芪对正常小鼠、免疫抑制小鼠免疫功能的影响,以期能为临床应用提供基础研究。
1 材料
1.1 药品与试剂 强壮灵合剂的制备,将处方中各味中药材清洗干净后,冷水浸12 h,用蒸汽夹层锅水煎煮3次,每次煎煮1 h。合并煎煮液,滤过,滤液放置6 h,取上清液浓缩后相当于含生药量2 g/mL,灌装,4℃保存备用。所有药物的动物用量根据 《保健食品检验与评价技术规范》中要求,实验所用剂量分别为15、30、60 g/kg 3个剂量,分别为人体用药剂量的10、20、30倍。
黄芪水煎液的制备同强壮灵合剂,质量浓度为 0.26 g/m L(其质量浓度是拆强壮灵合剂复方计算所得),4℃冰箱贮存备用。
玉屏风散水煎液按文献 [8]制备,最终质量浓度为1 g/m L,4℃冰箱贮存备用;转移因子口服液 (长春精优药业股份有限公司,批号20121108);盐酸左旋咪唑片 (山东仁和堂药业有限公司,批号120104);醋酸地塞米松片(天津天药药业股份有限公司,批号130211);氢化可的松注射液 (天津金耀氨基酸有限公司,批号H12020886);印度墨汁 (北京索宝生物科技有限公司,批号1108A022);其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 动物 SPF级昆明小鼠,体质量 (20±2.0)g,由大连医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(辽)2008-0002。
1.3 仪器 紫外-可见分光光度计 (岛津仪器有限公司,UV-2550);电热恒温水浴锅 (中仪国科科技有限公司,DK-S26);离心机(Backman Coulter Allegra X-30R Centrifuge,ALZ13C045);自动压力蒸汽灭菌器 (致微仪器有限公司,GR85DR);电子天平(Mettler Toledo XS204;Mettler Toledo BJ4202S)等。
2 方法
2.1 对氢化可的松免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响 取小鼠128只,雌雄各半,按体质量随机分为8组,每组16只。正常对照组 (生理盐水30mL/kg)、免疫抑制模型组 (生理盐水 30 mL/kg)、强壮灵合剂低剂量组(15 g/kg)、强壮灵合剂中剂量组 (30 g/kg)、强壮灵合剂高剂量组 (60 g/kg)、黄芪组 (8 g/kg)、玉屏风散组 (30 g/kg)、转移因子口服液组 (0.3 mg/kg,溶液中多肽含量),每鼠灌胃容量为30 mL/kg,连续30 d,在给药第18天除正常组外给其余7组腹腔注射氢化可的松50 mg/kg,连续7 d,造成小鼠免疫抑制[9]。最后一次给药后2 h,每鼠尾静脉注射用生理盐水稀释5倍的印度墨汁10 mL/kg,立即计时。于注入后2 min、10 min,分别从内眦静脉丛取血20μL,并立即将其加到2 m L 0.1%Na2CO3溶液中。于600 nm处测定吸光度 (OD),以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死,称定质量,取肝脏和脾脏,用滤纸吸干脏器表面血污,分别称定质量。以吞噬指数K表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a,K=(lg OD1-lg OD2)/(t2-t1),a=体质量/(体质量+肝质量)×[10]。
2.2 对氢化可的松免疫抑制小鼠迟发型过敏反应的影响
取小鼠128只,分组及给药方式同 “2.1”项。于给药第25天对所有小鼠进行脱毛处理,去毛面积3 cm×3 cm,用1%DNFB-丙酮蓖麻油溶液均匀涂布在所有小鼠腹部脱毛区致敏,于第30天用1%DNFB-丙酮蓖麻油溶液10μL均匀涂布于每鼠右耳背侧,于攻击后24 h处死小鼠并称定质量,剪下耳朵,用8 mm打孔器打下相同面积两耳片称定质量,以左右耳片质量差值作为肿胀度,并计算肿胀率。肿胀率 (%)=[(给药组耳质量-对照组耳质量)/对照组耳质量] ×100%。测完耳朵质量之后,取脾脏、胸腺,并称定质量。分别以每10 g小鼠的脾质量和胸腺质量作为脾脏、胸腺指数,脾脏指数=脾脏质量(mg)/体质量(g)× 10,胸腺指数=胸腺质量 (mg)/体质量 (g) ×10[11]。
2.3 对正常小鼠血清溶血素的影响 取雄性小鼠112只按体质量随机分为7组,每组16只。正常对照组 (生理盐水30mL/kg)、强壮灵合剂低剂量组(15 g/kg)、强壮灵合剂中剂量组 (30 g/kg)、强壮灵合剂高剂量组 (60 g/kg)、黄芪组 (8 g/kg)、玉屏风散组 (30 g/kg)、盐酸左旋咪唑组(0.02 mg/kg),每鼠灌胃容量为30 m L/kg,连续15 d。给药第11天,每鼠腹腔注射20% 绵羊红细胞 (SRBC)0.2 mL免疫,最后一次给药24 h后称定质量,眼眶取血收集7组小鼠血清。取1:500稀释的小鼠血清1 mL、5%SRBC 0.5 mL、10%补体1 mL,置37℃恒温水浴中孵育30 min,然后移至冰浴中终止反应,离心后取上清1 mL,加都氏试剂3 mL,摇匀放置10 min,于540 nm波长处测定吸光度OD值。取生理盐水1mL,加都氏试剂3mL为空白对照管。另取5%SRBC 0.25 mL,加入都氏试剂4 mL,测OD值,即为实验中所用SRBC半数溶血时的OD值。处死小鼠,各组小鼠分离脾脏、胸腺,滤纸吸干表面血污,称定质量,计算免疫器官指数。血清溶血素水平以半数溶血值 HC50表示,样品管中半数溶血值HC50按下式计算:HC50=(样品的OD值/SRBC半数溶血时的OD值)×稀释倍数[12]。
3 结果
3.1 对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响 由表1可知,与正常组相比,免疫抑制模型组吞噬指数显著降低(P<0.01),说明免疫抑制模型造模成功;灌胃给予强壮灵合剂低、高剂量的模型小鼠,其吞噬指数发生了明显回升,与正常小鼠无统计差异 (P>0.05);而分别灌胃了阳性对照药物转移因子口服液和黄芪单味药溶液恒的免疫抑制小鼠,其吞噬指数与模型组相比有升高,但不具有统计学意义,与正常小鼠相比仍然有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。
表1 强壮灵合剂对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞的影响(,n=16)
表1 强壮灵合剂对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞的影响(,n=16)
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,●P<0.05,●●P<0.01
吞噬指数正常组 — 7.90±2.96组别 剂量/(g·kg-1)●●模型组 — 4.57±1.00**强壮灵合剂低剂量组 15 5.83±2.70强壮灵合剂中剂量组 30 4.28±1.58*强壮灵合剂高剂量组 60 6.15±1.95●黄芪组 8 4.85±2.54*玉屏风散组 30 4.38±1.08**转移因子口服液组 0.3 4.99±2.13*
3.2 对免疫抑制小鼠免疫器官的影响 由表2可知,与正常组相比,免疫抑制模型组胸腺指数和脾脏指数显著降低(P<0.05或P<0.01),说明免疫抑制模型造模成功;黄芪组小鼠胸腺指数和脾脏指数、强壮灵合剂低剂量组、阳性药玉屏风散组脾脏指数发生了明显回升,与正常组相比无统计差异 (P>0.05)。
表2 强壮灵合剂对免疫抑制小鼠免疫器官的影响 (,n=16)
表2 强壮灵合剂对免疫抑制小鼠免疫器官的影响 (,n=16)
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与模型组比较,●P<0.05,●●P<0.01
组别 剂量/(g·kg-1)胸腺指数/(mg/10 g)脾指数/(mg/10 g)正常组 — 18.06±8.17●●46.47±14.29模型组 — 11.31±3.75** 34.37±13.57*强壮灵合剂低剂量组 15 12.21±6.32* 43.60±20.11强壮灵合剂中剂量组 30 8.62±2.99***●34.75±10.07*强壮灵合剂高剂量组 60 8.28±4.16***32.43±8.64**玉屏风散组 30 8.59±4.02 44.38±20.42黄芪组 8 12.73±8.25***38.02±10.67转移因子口服液组 0.3 12.10±5.40* 34.57±12.46*
3.3 对免疫抑制小鼠迟发型过敏反应的影响 由表3可知,与正常组相比,模型组肿胀显著低于正常组 (P<0.05),说明免疫抑制模型造模成功;与正常组相比,强壮灵合剂各剂量组、玉屏风散组、黄芪组、转移因子组均无差异 (P>0.05);与模型组相比,强壮灵合剂中、高剂量组、玉屏风散组、转移因子口服液组肿胀显著提高 (P<0.05或P<0.01)。说明强壮灵合剂能显著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。
表3 强壮灵合剂对免疫抑制小鼠迟发型过敏反应的影响(,n=16)
表3 强壮灵合剂对免疫抑制小鼠迟发型过敏反应的影响(,n=16)
注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,●P<0.05,●●P<0.01,●●●P<0.01
组别 剂量/(g·kg-1)耳肿胀差值/ mg 肿胀率/%正常组 — 6.83±3.27●-16.56模型组 — 3.02±2.14* -55.80强壮灵合剂低剂量组 15 4.57±2.07 -33.14强壮灵合剂中剂量组 30 6.62±3.02●●● -3.05强壮灵合剂高剂量组 60 5.90±3.44● -13.63玉屏风散组 30 8.20±0.01●●● 20.14黄芪组 8 5.41±5.18 -20.85转移因子口服液组 0.3 5.70±2.80●●
3.4 对正常小鼠免疫器官的影响 由表4可知,灌胃给予强壮灵合剂、黄芪组、玉屏风散组的小鼠,与正常小鼠相比其胸腺、脾脏指数有升高的趋势,但是无统计差异 (P>0.05)。
表4 强壮灵合剂对正常小鼠免疫器官的影响(,n=16)
表4 强壮灵合剂对正常小鼠免疫器官的影响(,n=16)
组别 剂量/(g·kg-1)胸腺指数/(mg/10 g)脾指数/(mg/10 g)正常组 —21.63±6.71 48.09±10.65强壮灵合剂低剂量组 15 25.84±11.62 53.19±12.69强壮灵合剂中剂量组 30 22.20±6.39 49.73±7.96强壮灵合剂高剂量组 60 22.20±6.80 43.88±12.41玉屏风散组 30 1.90±0.01 43.64±7.20黄芪组 8 24.55±9.75 49.30±10.92左旋咪唑组0.02 21.82±7.59 45.18±11.81
3.5 对正常小鼠血清溶血素的影响 由表5可知,与正常组相比,强壮灵合剂低剂量组、黄芪组、玉屏风散组、盐酸左旋咪唑组均可显著促进小鼠机体溶血素抗体的生成 (P<0.05或P<0.01);强壮灵合剂高剂量组可促进小鼠溶血素抗体的生成,但是与正常组相比无显著性差异 (P>0.05)。
表5 强壮灵合剂对正常小鼠血清溶血素的影响 (,n=16)
表5 强壮灵合剂对正常小鼠血清溶血素的影响 (,n=16)
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01
组别 剂量/(g·kg-1) 半数溶血值HC50正常组 —458.90±16.13强壮灵合剂低剂量组 15 479.20±13.05**强壮灵合剂中剂量组 30 457.80±13.46强壮灵合剂高剂量组 60 470.00±7.43玉屏风散组 30 475.10±18.47*黄芪组 8 477.60±15.69**左旋咪唑组 0.02 473.10±8.98*
4 讨论
脾脏和胸腺是外周免疫系统产生抗体的重要器官[9]。脾脏含有T淋巴细胞和巨噬细胞,是淋巴细胞迁移和接受抗原刺激后发生免疫应答、合成补体等免疫效应分子的重要场所,能直接参与细胞免疫;脾脏还富含B淋巴细胞和浆细胞,是全身最大的抗体产生的器官,特别是产生IgG、IgM,调节机体的体液免疫[13-15]。强壮灵合剂有增加免疫器官质量的趋势。
强壮灵合剂可使免疫抑制小鼠单核巨噬细胞吞噬活性明显升高 [中、高剂量组与正常对照组比较,均P>0.05;与模型组比较,高剂量组 (P<0.05)],说明提高小鼠单核巨噬细胞吞噬活性的最佳给药剂量可能为60 g/kg。
强壮灵合剂能够显著增强氢化可的松所致免疫低下小鼠的迟发型过敏反应。与正常对照组比较,强壮灵合剂低、中、高剂量对DNFB诱发的免疫抑制小鼠迟发型过敏反应引起的耳肿胀无明显差异 (P<0.05),随着剂量的增加,其促进小鼠抗体产生的能力逐渐增强,但是当继续增大用药剂量时,这种作用有减弱的趋势,因此我们认为强壮灵合剂增强小鼠特异性细胞免疫功能存在一个最佳剂量范围,实验剂量在30 g/kg左右效果最佳。
强壮灵合剂低剂量组血清溶血素半数溶血值HC50明显高于正常对照组 (P<0.05),提示强壮灵合剂对小鼠体液免疫有一定增强作用。黄芪组显著提高HC50,促进小鼠机体溶血素抗体的生成 (P<0.05或P<0.01),说明君药黄芪有增强免疫功能的趋势,在复方强壮灵合剂免疫调节中发挥了重要的作用。
强壮灵合剂是通过多途径来调节机体的免疫水平,并且跟其剂量有密切关系,按照临床的等效剂量计算,本研究的结果对临床剂量有一定的指导意义。本方剂还具有携带服用方便,省去了传统中药煎煮的麻烦,避免煎煮中药时产生的难闻气味等优点,所以不失为一种很好的增强免疫的药物。
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R285.5
B
1001-1528(2015)04-0862-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.038
2014-02-20
辽宁省自然科学基金项目 (201102043)
李 娜 (1987—),女,硕士生,研究方向为药理学。E-mail:921888804@qq.com
*通信作者:姜素云 (1958—),女,主任药师,主要从事药理学及药代动力学研究。