HPLC法同时测定五味消毒饮中4种成分

杨宏静， 陈 瑛， 方应权

（重庆三峡医药高等专科学校，重庆404120）

HPLC法同时测定五味消毒饮中4种成分

杨宏静， 陈 瑛*， 方应权

（重庆三峡医药高等专科学校，重庆404120）

目的建立HPLC法同时测定五味消毒饮中绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素4种活性成分。方法五味消毒饮水提液分析采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0μm），以0.05%三氟乙酸溶液（V/V）-乙腈为流动相，梯度洗脱，体积流量1.0 mL/min，检测波长为320 nm和344 nm，柱温30℃。结果绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的线性范围分别为4.96～49.6μg/mL，0.255～2.55μg/mL，2.51～25.1μg/mL和2.47～24.7 μg/mL（r≥0.999 8）。平均回收率在95%～105%范围内。结论该方法简便、灵敏、准确，可作为五味消毒饮的质量控制方法。

五味消毒饮；测定；绿原酸；咖啡酸；蒙花苷；秦皮乙素

五味消毒饮出自 《医宗金鉴》，由金银花20 g，野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天癸子各15 g组成，具有清热解毒、消散疔疮等功效，本方为治疗疔毒的常用名方，临床上广泛用于内科、外科、五官科、妇科等疾患［1-3］。绿原酸为金银花、野菊花和蒲公英的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、保肝利胆作用［4-5］。金银花和蒲公英中含有的咖啡酸具有抗菌、抗病毒、止血、提高中枢兴奋性和免疫促进等作用［2，6］。蒙花苷是野菊花中含有量较高的黄酮类成分，具有保护心脑血管、利胆保肝、抗癌、抗氧化等多种生物活性［7-8］。紫花地丁中的秦皮乙素是一种内酯类化合物，具有较强的抗氧化性，对中枢神经系统有一定的保护作用［9-10］。目前关于五味消毒饮中有效成分的测定仅集中于绿原酸和咖啡酸［2，11］。本研究采用高效液相色谱法同时测定五味消毒饮中的绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的量，为更好地对五味消毒饮进行质量评价提供参考。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪：二元泵、自动进样器，可变波长紫外检测器、在线脱气机、柱温箱等、Agilent ChemStation B.04.02工作站（美国Agilent公司）。AS3120型超声波清洗器 （奥特恩斯仪器有限公司），XS205DU电子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。

五味消毒饮各味药材均购自重庆市中药材公司，经由三峡中药研究所付绍智教授鉴定，与文献报道一致［3］。并按文献 ［3］方法制成五味消毒饮提取物（相当于含生药量1.0 g/mL）。

绿原酸 （批号130885-200103），咖啡酸 （批号 130753-200415）， 蒙 花 苷 （批 号 121383-200216），秦皮乙素 （批号125069-210216）均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；试验用水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流动相A为0.05%三氟乙酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱 （0～20 min，5～16%B；20～30 min，16%B；30～40 min，16%～22%B）；检测波长为320 nm（0～35 min），344 nm（35～40 nm）；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃，进样量20μL。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素对照品适量，置同一量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，即得混合对照品贮备溶液，分别为绿原酸4.96 mg/m L、咖啡酸0.255 mg/mL、蒙花苷2.51 mg/mL、秦皮乙素2.47 mg/mL。

2.3 供试品溶液的制备 参考文献方法［2］，精密吸取供试品1 mL至100 mL量瓶中，加入50%甲醇稀释至刻度，混匀，用孔径为0.22μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.4 阴性供试品溶液的制备 本研究中，金银花、野菊花和蒲公英含有绿原酸；金银花和蒲公英中含有咖啡酸；野菊花中含有蒙花苷；紫花地丁含有秦皮乙素。按处方比例分别制备缺上述药材的阴性供试品，并按照 “2.3”项下方法分别制备阴性供试品溶液。

2.5 线性关系 分别精密吸取 “2.2”项下制备的混合对照品贮备溶液5 m L至50 mL量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，再分别精密吸取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL至50 mL量瓶中，以50%甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20μL进样，按 “2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积值Y对质量浓度X（μg/mL）进行线性回归，得五味消毒饮中4个活性成分的标准曲线方程、相关系数 （r）和线性范围，见表1。

表1 五味消毒饮中4种活性成分的线性关系Tab.1 Linear relationship of four active com ponents in W uwei Xiaodu Drink

2.6 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液20μL，重复进样6次，记录峰面积。结果显示，绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、秦皮乙素的峰面积RSD值分别为1.6%、1.3%、0.58%和0.85%，说明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批五味消毒饮 （批号20130501）6份，按 “2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件测定，将测定绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的峰面积代入 “2.5”项下的回归方程，计算。结果显示，绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的RSD分别为1.1%、1.2%、0.98%、1.3%，表明方法的重复性良好。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s

2.8 稳定性试验 精密吸取五味消毒饮1 m L，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，按照 “2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8 h进样，测定各成分的峰面积，计算。结果显示，绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素峰面积RSD值分别为1.5%、1.9%、0.85%和1.4%，表明在室温条件下，供试品溶液在8 h内稳定性良好。

2.9 加样回收试验 取已知各成分含有量的供试品 （批号20130501）6份，每份1.0 mL，分别精密加入一定量的绿原酸（49.6 mg/mL）、咖啡酸（2.55 mg/mL）、蒙花苷（25.1 mg/mL）和秦皮乙素（24.7 mg/mL）对照品溶液，按“2.3”项下方法制备，依法测定，即得。结果见表2。

2.10 样品的测定 取3个批号的样品，分别按“2.3”项下方法制备不同批号的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，外标法计算绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的量，结果见表3。

3 讨论

中药化学成分呈多样性和复杂性，对于复方制剂，在定量指标上应尽可能选择多指标控制其质量［12］。本研究在前期工作［11］和文献［2］基础上，采用HPLC法同时测定五味消毒饮中绿原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素，方法简便、可靠、灵敏，为建立和完善该制剂质量标准提供参考。

根据文献 ［12-15］，结合预试验，以水、磷酸溶液和三氟乙酸溶液作为水相，甲醇和乙腈作为有机相，考察了各种流动相组合对色谱分离的影响。结果显示，以0.05%三氟乙酸溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，所测各成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，色谱峰对称性良好，理论塔板数以秦皮乙素计不低于4 000。

表2 加样回收率Tab.2 Results of recovery tests

表3 样品测定结果 （，n=3）Tab.3 Determ ination results of sam p les（，n=3）

表3 样品测定结果 （，n=3）Tab.3 Determ ination results of sam p les（，n=3）

批号 绿原酸/（mg·m L-1）咖啡酸/（mg·mL-1）蒙花苷/（mg·m L-1）秦皮乙素/（mg·m L-1）20130501 1.96±0.05 0.108±0.01 0.982±0.07 0.956±0.07 20130503 1.85±0.12 0.121±0.02 0.965±0.10 0.112±0.10 20130505 1.91±0.07 0.115±0.02 0.102±0.09 0.981±0.15

经全波长扫描，并结合文献，绿原酸、咖啡酸［13］和蒙花苷［14］在320 nm波长均有明显吸收，且杂质干扰少。秦皮乙素在344 nm处有最大吸收［15］。利用检测器可变波长的性能，每次进样测定时，0～35min设定波长为320 nm，测定绿原酸、咖啡酸和蒙花苷，35～40 min波长设为344 nm，测定秦皮乙素。

［1］黄水仙，田道法.五味消毒饮临床应用研究进展［J］.湖南中医药导报，2002，8（9）：523-535.

［2］张 宇，金玲宇，韩 飞，等.RP-HPLC法同时测定五味消毒饮口服液中绿原酸和咖啡酸的含量［J］.沈阳药科大学学报，2008，25（11）：904-907.

［3］张晓青，陈伶利，李 斌，等.应用压电微生物传感仪研究五味消毒饮抑菌作用的量效关系［J］.中草药，2013，44（18）：2569-2572.

［4］沈 熊，梁 健，杨春欣，等.大鼠血浆中绿原酸和木犀草苷的 HPLC法测定［J］.中成药，2012，34（11）：2099-2102.

［5］宋 健，张会敏，郭承军，等.金银花抗流感病毒活性成分峰的化合物归属研究［J］.中成药，2011，33（6）：1017-1021.

［6］周燕园.HPLC法测定墨旱莲配方颗粒中绿原酸和咖啡酸［J］.中成药，2012，34（2）：374-377.

［7］陈立柱，刘 辉，潘鹏飞.HPLC法同时测定野菊花中绿原酸和蒙花苷的含量［J］.中国药师，2011，14（12）：1753-1755.

［8］黄兰芷，刘 毅，蔡艳华.RP-HPLC对野菊花药材中蒙花苷和木犀草素的含量测定［J］.中成药，2009，31（8）：1242-1246.

［9］胥爱丽，江洁仪，罗文汇，等.HPLC法测定紫花地丁配方颗粒中秦皮乙素的含量［J］.江西中医药，2013，44（3）：61-62.

［10］梁珊珊，陈汝筑，朱小南，等.秦皮乙素对Aβ25-35诱导的Tau蛋白过度磷酸化的作用［J］.热带医学杂志，2013，13（10）：1181-1184.

［11］杨宏静，方应权.高效液相色谱法测定五味消毒饮中绿原酸含量［J］.现代医药卫生，2014，30（1）：21-22.

［12］姜 鸿，王光函，张 颖，等.HPLC法测定火绒草中原儿茶酸、原儿茶醛、绿原酸和咖啡酸［J］.中成药，2011，33（11）：2023-2025.

［13］陈晓鹏，鄂秀辉，夏忠庭，等.HPLC法同时测定养血清脑颗粒中 7个主要成分［J］.中成药，2013，35（9）：1921-1924.

［14］林丽美，夏伯候，刘菊妍，等.RP-HPLC法同时测定夏桑菊颗粒中绿原酸、异迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷［J］.中成药，2013，35（11）：2411-2415.

［15］张苏阳，陈佳正，李晓英，等.藏药八味秦皮丸中秦皮甲素、秦皮乙素和麝香酮的定量测定［J］.中成药，2011，33（6）：984-988.

Sim ultaneous determ ination of four active com ponents from W uwei Xiaodu Drink

YANG Hong-jing， CHEN Ying*， FANG Ying-quan

（Department of Pharmacy，Chongqing Three GorgesMedical College，Chongqing 404120，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for simultaneously determining chlorogenic acid，caffeic acid，linarin，and aesculetin from Wuwei Xiaodu Drink.METHODSThe analysis of aqueous extract ofWuwei Xiaodu Drink was performed on Agilent Eclipse XDB-C18column（250 mm×4.6 mm，5.0μm）with mobile phase consisting of 0.05%（V/V）trifluoroacetic acid-acetonitrile in a gradient elution mode.The wavelength was set at 320 nm and 344 nm for different components.Flow ratewas1.0mL/min and column temperature wasmaintaned at 30℃.RESULTSThe linear ranges of chlorogenic acid，caffeic acid，linarin，and aesculetin were 4.96-49.6μg/mL，0.255-2.55μg/mL，2.51-25.1μg/mL，and 2.47-24.7μg/m L（r≥0.999 8），respectively.The average recoverieswere between 95%～105%.CONLUSIONThemethod issimple，sensible，accurate and can be used for the quality control ofWuwei Xiaodu Drink.

Wuwei Xiaodu Drink；determination；chlorogenic acid；caffeic acid；linarin；aesculetin

R927.2

A

1001-1528（2015）04-0778-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.018

2014-05-19

重庆三峡医药高等专科学校自然科学基金项目 （2011xz09）

杨宏静 （1969—），男，硕士，讲师，研究方向为中西药联合应用。Tel：13896286555

*通信作者：陈 瑛 （1963—），女，副教授，研究方向为有机化学。Tel：（0433）58556103，E-mail：601861207@qq.com

日期：2014-07-31

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140731.1323.001.html