浸润性乳腺导管癌与原位导管癌分子标志物的临床研究

张刚，齐娟，李中，林晓萌，蔡倩倩，郝鑫

（河北大学附属医院，河北 保定 071000）

浸润性乳腺导管癌与原位导管癌分子标志物的临床研究

张刚，齐娟，李中，林晓萌，蔡倩倩，郝鑫

（河北大学附属医院，河北 保定 071000）

目的寻找并探讨乳腺癌组织可能分子标志物的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学方法分别检测浸润性乳腺导管癌、乳腺导管原位癌与乳腺增生症组织中BRCA1、BRCA2、C-erbB-2、P53、 Bcl-2的表达情况，分析其改变原因及与浸润性乳腺癌发生的相关关系。结果100例浸润性乳腺癌中，分子标志物的表达（BRCA1、BRCA2、C-erbB-2、P53、 Bcl-2）与乳腺导管原位癌及乳腺增生症相比，均发生了一定程度的变化，其中BRCA1和P53表达情况的改变与浸润性乳腺癌的发生相关（P＜0.05）。结论BRCA1和P53基因蛋白表达可以作为乳腺癌预后的敏感因子及评估乳腺癌生物学行为和预后的参考指标。

乳腺癌；BRCA1；BRCA2； C-erbB-2；P53；Bcl-2；免疫组化

本文引用：张刚,齐娟,李中,等.浸润性乳腺导管癌与原位导管癌分子标志物的临床研究[J].医学研究与教育,2015,32(3): 31-35.

中国乳腺癌发病率呈现逐年增高趋势，是妇女常见的恶性肿瘤之一，因此，乳腺癌的病因学及预后研究成为医学研究的热点。以往医学，肿瘤直径、肿瘤生长部位、肿瘤临床分期及组织学分级、淋巴结是否转移等因素用于判断乳腺癌的预后。随着分子生物学的发展，分子标志物的重要性和临床意义越来越得到人们的重视，截止到目前，已有一些分子标志物应用于临床，指导乳腺癌临床治疗和预测预后方面发挥重要作用。

1 材料和方法

1.1 临床资料

2008年6月至2012年6月，河北大学附属医院病理科手术切除乳腺浸润性导管癌石蜡包埋标本100例，平均年龄（48.35±5.14）岁，选取乳腺导管原位癌石蜡包埋标本60例，平均年龄（40.52±5.13）岁，乳腺增生症石蜡包埋标本100例，平均年龄（39.52±6.22）岁，组间年龄差异无统计学意义。

1.2 主要试剂

兔抗人BRCA1、BRCA2、C-erbB-2、P53、Bcl-2单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SP免疫组化试剂盒（PV9000）购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。DAB显色剂购自福建迈新技术有限公司。

1.3 染色方法

组织标本以4%甲醛缓冲液固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片后进行脱蜡，PBS 洗涤，免疫组化具体步骤按照试剂盒说明书进行，染色时每批均设立阴性对照（以PBS代替Ⅰ抗）和阳性对照（已知阳性片由试剂公司提供）。

1.4 结果判定

BRCA1、 BRCA2染色以癌细胞核、部分病例以癌细胞质出现棕黄色颗粒且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性[1-2]；Bcl-2主要定位于细胞质，同时也可见于细胞核及细胞膜；P53蛋白阳性产物主要在细胞核；C-erbB-2主要见于细胞膜着色。以细胞核，细胞质或细胞膜出现背景清晰的棕黄或棕褐色颗粒为阳性，阳性细胞占肿瘤细胞0～5%记为0分，6%～20%记为1分，21%～50%记为2分，50%以上记为3分。0分和1分视为阴性，2分和3分视为阳性。

1.5 统计学分析

应用SPSS18.0统计软件包进行分析，蛋白表达与各实验组之间的关系采用卡方检验，P＜0.05定为差异有统计学意义。

2 结果

BRCA1蛋白在乳腺癌组织、乳腺原位癌组织和乳腺增生症组织中的阳性率分别为18.00%、40.00%和65.00%，3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。BRCA2蛋白在乳腺癌组织、乳腺原位癌组织和乳腺增生症组织中的阳性率分别为49.00%、56.67%和58.00%，3组比较差异无统计学意义。C-erbB-2蛋白在乳腺癌组织、乳腺原位癌组织和乳腺增生症组织中的阳性率分别为37.00%、28.00%和26.00%，3组比较差异无统计学意义。P53蛋白在乳腺癌组织、乳腺原位癌组织和乳腺增生症组织中的阳性率分别为42.00%、31.67%和17.00%，3组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。Bcl-2蛋白在乳腺癌组织、乳腺原位癌组织和乳腺增生症组织中的阳性率分别为39.00%、51.67%和53.00%，3组比较无统计学意义。BRCA1、BRCA2、C-erbB-2、P53,Bcl-2在乳腺导管原位癌与乳腺导管癌中的表达见图1—10。

表1 BRCA1、BRCA2、C-erbB-2、P53、Bcl-2在乳腺组织中的表达

图1 BRCA1在乳腺导管原位癌中高表达（SP×200）

图2 BRCA1在乳腺导管癌中低表达（SP×200）

图3 BRCA2在乳腺导管原位癌中高表达（SP×200）

图4 BRCA2在乳腺导管癌中低表达（SP×400）

图5 c-erbB-2在乳腺导管原位癌低表达（SP×400）

图6 C-erbB-2在乳腺导管癌中高表达（SP×400）

图7 P53在乳腺导管原位癌中低表达（SP×200）

图8 P53在乳腺导管癌中高表达（SP×200）

图9 Bcl-2在乳腺导管原位癌中高表达（SP×400）

图10 Bcl-2在乳腺导管癌中低表达（SP×400）

3 讨论

目前，乳腺癌发病率居女性肿瘤前列，严重威胁着女性健康。肿瘤直径，肿瘤生长部位，肿瘤临床分期及组织学分级，淋巴结是否转移等因素常用于判断乳腺癌的预后，随着分子生物学的发展，分子标志物的作用不断被认识和应用，其重要性和临床意义也越来越得到人们的重视。中外学者对乳腺癌的病因及预后研究较多，也较深入，认识到乳腺癌的发生和发展是一个众多因素共同作用的过程。

20世纪90年代，学者[3-4]发现BRCA1和BRCA2均是重要的抑癌基因，与乳腺癌的发生，尤其是家族遗传性乳腺癌的发生有密切关系， BRCA1定位于人染色体17q21染色体上。研究表明，BRCA1、BRCA2基因突变与家族性乳腺癌发病关系最为密切，据统计，在欧美国家中，家族性乳腺癌患者BRCA1癌基因突变率高达80%[5]，散发性乳腺癌病例中也发现有BRCA1基因突变，BRCA1、BRCA2蛋白表达下调[6]。BRCA2基因定位于13q12染色体上，其编码的蛋白含3418个氨基酸，有27个外显子。如上所述，BRCA2蛋白与BRCA1共同在细胞周期的调解中发生作用。研究[7]表明，该蛋白在家族性乳腺癌中突变较多，散发性乳腺癌较少。正常生理状态下，当细胞处于细胞周期S期和G2期时，BRCA1与BRCA2蛋白存在于细胞核周边，参与调节细胞周期、DNA损伤修复、细胞生长与凋亡及转录等多种生物学行为。当这一过程发生异常，即BRCA1和BRCA2蛋白表达下调，就会促进正常细胞恶变和肿瘤的发生。

C-erbB-2是目前公认的乳腺癌预后治疗相关分子标志物。C-erbB-2是与乳腺癌预和治疗关系密切，且研究较多的基因，正常乳腺组织中表达较低，乳腺癌组织中表达上调[8]。P53[9]也是与人类肿瘤密切相关的抑癌基因，突变型P53更是几乎存在于所有恶性肿瘤中，其突变率高直接导致肿瘤患者的预后差，分化低，生存时间短。Bcl-2[10]定位于人染色体18q21上，存在于恶性肿瘤细胞质及细胞膜，其生理作用与细胞周期无关，直接控制着细胞的分化生长及凋亡，其表达与肿瘤的恶性程度呈负相关。

本实验免疫组化结果显示，BRCA1、BRCA2及Bcl-2蛋白在乳腺癌组织、乳腺导管原位癌组织和乳腺增生症组织中的表达呈上升趋势，其中，BRCA1的表达3组之间差异有统计学意义（P＜0.01）。C-erbB-2、P53蛋白在乳腺癌组织、乳腺导管原位癌组织和乳腺增生症组织中的表达呈下降趋势，其中P53的表达在3组之间差异有统计学意义（P＜0.01）。与上述文献结果一致。

综上所述，乳腺癌分子标志物的研究和应用，为临床医生的治疗提供了有力保障，一些新的分子标志物的出现，还需要进一步的研究来作为应用依据。BRCA1和P53基因蛋白表达有望作为乳腺癌预后的敏感因子，成为评估乳腺癌生物学行为和预后的参考指标。

[1]纪小龙,施作霖.诊断免疫组织化学[M].北京: 军事医学出版社,1997: 25.

[2]MIKI Y,SWENSEN J,SHATTULK-EIDENS D.et al.Astrony candidate for the breast cancer and ovarion cancer susceptibility gene BRCA1[J].Science,1994,266: 66-71.

[3]MILNE R L,ANTONIOU A C.Genetic modifiers of cancer risk for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers[J].Ann Oncol,2011,22 ( Suppl 1): 11-17.

[4]缑文斌,王智,苗娜,等.维吾尔族和汉族女性散发性乳腺癌 BRCA1 及 BRCA2 基因单核苷酸多态性研究[J].新疆医科大学学报,2015,38(3): 278-287.

[5]解云涛.家族性乳腺癌 BRCA1、2 基因突变检测及临床应用[J].中国实用外科杂志,2013,33(3): 233-235.

[6]马金柱,张嘉玲,刘明.BRCA1 与 p53 在散发性乳腺癌中的表达[J].实用肿瘤杂志,2011,26(3): 233-236.

[7]马金柱.乳腺癌与 BRCAl 及 BRCA2 基因相关性研究进展[J].内蒙古医学杂志,2012,44(10): 1212-1213.

[8]史春颖,刘源,李睿,等.乳腺导管原位癌的发病危险因素及生物学指标 ER、PR、C-erbB-2 表达的研究[J].哈尔滨医科大学学报,2015,49(1): 52-59.

[9]汪小霞,孟刚,李丽,等.乳腺癌中 EZH2 和 p53 蛋白表达及其临床意义[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(3): 273-276.

[10]任宇鹏,宋纯,张昊.结肠癌组织中 Beclin1 及 Bcl-2 表达变化及意义[J].山东医药,2015,55(8): 34-36.

（责任编辑：高艳华）

Clinical significance of molecular markers expression in invasive ductal breast cancer and ductal carcinoma in situ

ZHANG Gang,QI Juan,LI Zhong,LIN Xiaomeng,CAI Qianqian,HAO Xin
(Affliated Hospital of Hebei University,Baoding 071000,China)

ObjectiveTo explore the clinical signifcance of molecular markers expression in invasive ductal breast cancer and ductal carcinoma in situ.MethodsSP immunohistochemical were used to detect the expression of molecular markers（BRCA1,BRCA2,C-erbB-2,P53,Bcl-2） in 100 cases of invasive ductal breast cancer,60 cases of ductal carcinoma in situ,and 100 cases of Hyperplastic disease.The changes reasons and correlation between molecular markers and breast cancer were analyzed.ResultsContrast of ductal carcinoma in situ and Hyperplastic disease,biological molecular markers of 100 cases of invasive ductal breast cancer (BRCA1,BRCA2,C-erbB-2,P53,Bcl-2) all had some changes,and the changes of BRCA1,P53 expression were correlated with breast cancer（P＜0.05）.ConclusionExpression of BRCA1,P53 protein can be helpful in the prediction of the biological behavior and prognosis of invasive ductal breast cancer.

breast cancer; BRCA1; BRCA2; C-erbB-2; P53; Bcl-2; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.03.007

R287

A

1674-490X(2015)03-0031-05

2015-05-05

河北省2011年度医学科学研究重点课题计划项目（ZD20110521）

张刚（1975—），男，河北保定人，副主任医师，在读博士，主要从事普通肿瘤研究。

E-mail: zhanggang268@sina.com

齐娟（1978—），女，河北保定人，副主任护师，主要从事普通肿瘤研究。E-mail: 86781938@qq.com