EV71 及CA16 不同检测方法敏感度及特异性比较

李 华 杨 婷 姜广菊 何晓娟 岳 磊 谢天宏 杨水芝 朱凡丽 龙润乡 杨 蓉 罗芳宇 谢忠平

手足口病(hand - foot - and - mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的，为全球性传染病，多发生于5 岁以下儿童，尤以＜3 岁儿童发生率最高［1］。可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。病毒还可侵犯呼吸系统、中枢神经系统等引起脑炎、肺水肿、驰缓性麻痹、心肌炎等症状，个别重症病例还可导致死亡［2～4］。

引起手足口病的肠道病毒有20 多种，其中以柯萨奇病毒A16 型(coxsackievirus A16，C A16)和肠道病毒71 型(enterovirus 71，EV71)最为常见［2］。国家卫生和计划生育委员会(原卫生部)于2008 年5 月2日将HFMD 纳入丙类法定传染病管理，并制订了相应的诊疗、防控指南［5，6］。2013 年统计手足口病发病1825649 例，死亡人数620 例，占丙类传染病总死亡数百分比是81.50% 。CA16 和EV71 引起的HFMD临床表现相似，难以鉴别。而且EV 71 和CA 16 在遗传学上同源性也较高，核苷酸序列有77%的同源性，氨基酸序列的同源性为89%［7］。因此，研究快速、准确、特异地对EV 71 和CA 16 的诊断方法尤为重要。目前实验室检测手足口病方法，包括病毒分离培养法、血清学中和试验法、ELISA 法、病原体核酸RT -PCR 法及荧光定量PCR 法［8～13］。针对目前品种繁多的检测方法，本试验通过用不同方法、同种方法的不同试剂，检测分离的20 株手足口病病毒(CA16、EV71 各10 株)，并进行对比，分析检测方法及检测试剂的敏感度及特异性，同时为自制的ELISA 抗原检测试剂盒找到可参比的试剂和方法。

材料与方法

1.检测用病毒:选本实验室从临床患儿标本中(临床标本的采集及临床研究已申请“知情同意书”免签申请，得到伦理委员会批准)分离、并经过鉴定的EV71 病毒株及CA16 毒株各10 株，进行稀释，选择原倍、10-3及10-63 个浓度，所有的检测方法(试剂)均同时对该20 个毒株的不同浓度(稀释度)病毒进行检测，以确定其敏感度及特异性。

2.检测用细胞:Vero 细胞由笔者单位质量检定室提供。

3.EV71 及CA 16 荧光定量PCR 检测试剂:共选择市场上销售量大的5 个试剂公司生产的荧光定量PCR 检测试剂盒，分别编号为A 公司、B 公司、C 公司、D 公司及E 公司。实验的操作及结果的判定均严格按各试剂的使用说明书进行操作。

4.RT-PCR 检测方法:按表1 设计VP1 引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成［14］;采用核酸提取试剂盒(硅胶膜吸附法)提取病毒核酸，用Prime Script One Step RT-PCR Kit(TaKaRa 公司，大连)对VP1 片段进行扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳。

表1 EV71 及CA16 RT-PCR 引物设计序列

5.EV71 及CA16 ELISA 抗原检测试剂:由笔者所在研究室制备［8，9］。

6.细胞培养法:将不同稀释度的病毒接种Vero 细胞，37℃培养7 天观察细胞病变情况，以出现病变的最高稀释度为检测敏感度。

结 果

1.EV71 及CA16 不同检测方法的敏感度:经过对检测结果进行统计分析，其检测方法的敏感度依次为:荧光定量PCR 检测方法、细胞培养病变法(中和法)、普通RT-PCR(VP1)及ELISA 抗原检测法。对于病毒含量达到106CCID50/ml 的样品，所有检测方法的检出率均可达100%;对于病毒含量达到103CCID50/ml 的样品，细胞培养法检出率达100%，荧光定量PCR 检测试剂检出率为80% ～100%，普通RT-PCR(VP1)检测率约50%，而ELISA 抗原检测试剂检出率仅为10%;对于＜20 CCID50/ml 病毒载量的样品，则仅有荧光定量PCR 可检出，检出率为0 ～50%(表2、表3)。

2.EV71 及CA16 不同检测试剂的敏感度:CA16检测试剂，对于病毒量达到106CCID50/ml 样品，所用5 个生产厂家的荧光定量PCR 检测试剂均能100%检出;对于病毒量达到103CCID50/ml 级样品，荧光定量PCR 检测试剂检出率为80% ～100%，对于＜20CCID50/ml 病毒量的样品，则只有荧光定量PCR 检测试剂才可检出。荧光定量PCR 检测EV71 的敏感度顺序为D ＞B ＞A=E=C;荧光定量PCR 检测CA16 的敏感度顺序为C ＞E ＞D ＞B ＞A (表4、表5)。

3. 检测方法的特异性:经检测ELISA 抗原检测试剂、细胞培养病变法(中和法)及普通RT - PCR(VP1)3 种方法均未发现非特异性假阳性结果，表现为检测方法特异性好，而所用的5 个生产厂家的荧光定量PCR 检测试剂均出现不同程度的非特异性假阳性结果，即荧光定量PCR 检测方法特异性差(表2、表3)。

4.检测试剂的特异性:5 个生产厂家的荧光定量PCR 检测试剂均出现不同程度的非特异性假阳性结果，假阳性率为10% ～100%;通过对5 家EV71 荧光定量检测试剂的特异性进行分析，其顺序为D ＞A ＞E ＞C ＞B;检测CA16 的特异性顺序为A ＞C ＞D ＞E ＞B，呈现出假阳性率为高病毒量的样品假阳性率高，低病毒量的样品假阳性率低的趋势(表4、表5)。

表2 EV71 4 种检测方法敏感度及特异性分析

表3 CA16 4 种检测方法敏感度及特异性分析

表4 EV71 检测试剂敏感度及特异性分析

表5 CA16 检测试剂敏感度及特异性分析

5. EV71 及CA16 荧光定量PCR 检测试剂假阳性结果分析:通过对产生假阳性样品的CT 值进行分析，除C 公司EV71 试剂检测CA16 样品CT 值集中在20 ～30 外，其余均集中在＞30 的区域，接近阳性标准的上限值，应该是在灰区的范围(表6)，所以确定可疑值范围或设定灰区是有必要的。从研究的结果分析，凡CT 值在灰区范围内的样品都应按要求进行重试，这样可以减少非特异阳性结果的产生，保证检测结果的可靠性和准确性。

表6 EV71 及CA16 荧光定量PCR 检测试剂假阳性结果CT 值分析

讨 论

对手足口病主要病原体EV71 及CA16 的检测，最初采用病毒培养的方法，但病毒培养方法耗时长，不能满足临床上早期诊断和治疗的要求。随后建立了ELISA 方法，加快了EV71 及CA16 病毒的检测速度。随着分子生物学技术的发展，RT -PCR 及荧光定量PCR 技术获得广泛应用。

从检测样品的分析结果显示，荧光定量PCR 检测法、细胞培养病变法(中和法)、普通RT - PCR(VP1)及ELISA 抗原4 种检测方法，荧光定量PCR检测方法敏感度最高，且可检测到＜20CCID50/ml 病毒载量的样品，这与报道一致，荧光定量PCR 检测方法最低检测限达到9.22 ×102PFU/ml 的样本，敏感度比RT-PCR 方法高10 倍［15，16］。但荧光定量PCR检测法也有不足，即特异性差，易造成误差，出现假阳性。对于病毒量达到103CCID50/ml 级样品，细胞培养法能100%检出、荧光定量PCR 检测试剂检出率为80% ～100%不等、普通RT -PCR(VP1)检测率约为50%，而ELISA 抗原检测试剂检出率仅为10%左右，由此试验结果显示，细胞培养法检出率高，是可以与荧光定量PCR 相提并论的，只是由于细胞培养法耗时长，对实验室条件及操作人员要求严格，且一般县级单位不具备细胞培养的硬件设施条件和要求，所以选择荧光定量PCR 或者普通RT -PCR 进行病毒检测。

特异性的检测可以看出所用5 个生产厂家的荧光定量PCR 检测试剂均出现不同程度的非特异性假阳性结果，假阳性率出现的趋势是高病毒量的样品假阳性率高，低病毒量的样品假阳性率低，且假阳性率从10%至100%不等，这与报道不相符［17～19］。这可能是由于本次所用的样品为细胞培养的病毒液，病毒含量相对于临床采集样品具有病毒载量高的原因所致。EV71 及CA16 荧光定量PCR 检测的结果是根据CT 值进行判定的，所以CT 值大于试剂盒阳性判定标准值为阴性，反之为阳性，在灰区为可疑值，应进行重试。在本实验中，EV71 试剂检测CA16 样品有50.0%(15/30)在可疑值范围内、CA16 试剂检测EV71 样品有53.6%(15/28)在可疑值范围内，在此这些样品应按说明书要求进行重试2 次，这样可以减少非特异阳性结果的产生，有必要的还进行敏感细胞的分离培养，降低假阳性的发生率。有研究结果显示，RT -PCR 法与RD 细胞病毒分离法检测出的阳性标本按不同分类统计比较后，差异无统计学意义［20］。从本试验结果看，细胞培养病变法(中和法)及普通RT-PCR(VP1)法检测出的阳性标本按不同分类统计比较后，两者差异也无统计学意义，这与报道一致。

综上所述，分析比较5 个生产厂家检测试剂的敏感度及特异性，可以得出检测EV71 和CA16 分别选择D、C 厂家的荧光定量PCR 试剂效果较好。4 种检测方法中，虽然细胞培养病毒分离是确定手足口病病原体的金标准，但所需时间相对较长，本试验结果显示细胞培养病变法及普通RT -PCR(VP1)法检测的结果一致性高，所以在应急阶段可首选普通RT -PCR(VP1)法。

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