HPLC法同时测定胡颓子叶中槲皮素和山柰酚

黄丽杰， 崔永霞， 刘 伟， 张伟欣， 林帅军， 李 睢

（河南中医学院分析测试中心，河南郑州450008）

HPLC法同时测定胡颓子叶中槲皮素和山柰酚

黄丽杰， 崔永霞， 刘 伟*， 张伟欣， 林帅军， 李 睢

（河南中医学院分析测试中心，河南郑州450008）

目的建立同时定量测定胡颓子叶中槲皮素和山柰酚的方法。方法胡颓子叶盐酸-乙醇提取液分析采用反相高效液相色谱法，ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl Analytical色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长366 nm；进样量10μL。结果槲皮素和山柰酚在2.4～48μg/mL（r=0.999 8）和12.8～256μg/mL（r=0.999 9）范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，平均回收率分别为98.8%、99.4%，RSD值分别为1.7% （n=6）、1.1% （n=6）。不同产地胡颓子叶中槲皮素和山柰酚的含有量范围分别为0.299 3～2.12 mg/g、2.864 3～8.079 7 mg/g。结论该法简便、快速、准确、重复性好，对胡颓子叶的综合质量评价有一定的参考价值。

胡颓子叶；槲皮素；山柰酚；HPLC

胡颓子叶为胡颓子科胡颓子属常绿植物胡颓子Elaeagnus pungens Thunb.的干燥叶，其性平、味酸，具有敛肺、平喘、止咳的作用［1］。是用于止咳平喘的中成药海珠喘息定片等的主要原料药材，临床效果良好［2］。胡颓子叶的化学成分有单宁、黄酮苷、生物碱、有机酸、三萜及甾醇类化合物等［3-11］。目前对于胡颓子叶中化学成分的定量测定报道研究很少，为深入挖掘我国宝贵的中药资源，本实验采用HPLC法，同时测定了不同产地胡颓子叶中槲皮素和山柰酚的量，为胡颓子叶的质量评价、控制及进一步的开发利用提供参考。

1 仪器与材料

安捷伦1260高效液相色谱仪 （美国安捷伦科技有限公司）；METTLER AE240电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；FN202-2型电热干燥箱 （长沙仪器仪表厂）；元素型1820C摩尔纯水机 （上海摩勒科学仪器有限公司）；RT-01型粉碎机 （浙江温岭市大海药材器械厂）；HWS型水浴锅 （上海一恒科学仪器有限公司）。

甲醇、乙腈 （色谱纯，Tedia公司）；磷酸（分析纯，洛阳昊华化学试剂有限公司）；蒸馏水（自制）；槲皮素对照品 （批号110824，上海融禾医药科技有限公司），山柰酚对照品 （批号MUST-13121112，成都曼思特生物科技有限公司）；胡颓子叶由河南中医学院药学院董诚明教授鉴定为胡颓子科胡颓子属植物胡颓子的干燥叶，产地分别为广西、云南、河南、安徽、江苏、四川、贵州、湖北、陕西、蘄春。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl Ana-lytical（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液 （A）-乙腈 （B），梯度洗脱（0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～20%B；10～15 min，20%～25%B；15～20 min，25%～28%B；20～25 min，28%～28%B；25～30 min，28%～30%B；30～35 min，30%～40% B）；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长366 nm；进样量10μL。按此色谱条件检测对照品溶液与供试品溶液，结果供试品中槲皮素和山柰酚的色谱峰与其他色谱峰均分离良好，峰形对称。色谱见图1。

图1 混合对照品（A）及胡颓子叶样品（B）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and leaves of E.pungens（B）

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取槲皮素和山柰酚对照品适量，置25mL量瓶中，各加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即分别得每1 mL含40 μg的槲皮素对照品溶液和每1 mL含0.3 mg的山柰酚的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取药材粉末约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入25%盐酸-乙醇（1∶4）100 mL，称定质量，加热回流1.5 h，放冷，再称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 线性关系的考察 分别精密吸取 “2.2”项下两个对照品溶液适量，各配制成质量浓度为2.4、12、24、36、48μg/m L的槲皮素对照品溶液和质量浓度为12.8、64、128、192、256μg/mL的山柰素对照品溶液，各精密进样10μL，按 “2.1”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，计算得槲皮素的线性回归方程为Y=3.163 8X-2.021，r=0.999 8；山柰酚的线性回归方程为Y=6.871 5X-5.665 7，r=0.999 9，结果表明，槲皮素在2.4～48μg/mL（r= 0.999 8）范围内线性关系良好，山柰酚在12.8～256μg/mL（r=0.999 9）范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取槲皮素和山柰酚对照品溶液适量，按 “2.1”项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，计算其RSD，槲皮素和山柰酚的RSD值分别为0.3%（n=6）和0.8%（n=6）。

2.6 稳定性试验 取按 “2.3”项下的制备条件制成的供试品溶液，于0、3、6、9、12、24 h测定峰面积，槲皮素RSD值为1.4% （n=6），山柰酚RSD值为0.6% （n=6），结果表明槲皮素和山柰酚的量均未发生明显的改变，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一产地的胡颓子叶药材粉末适量，精密称定，平行6份，制备成供试品溶液，测定峰面积，分别计算槲皮素和山柰酚的量，结果其RSD值分别为0.6% （n=6）和1.1%（n=6），表明实验具有可重复性。

2.8 加样回收率试验 取江苏产地已知槲皮素和山柰酚含有量的胡颓子叶药材粉末约0.5 g，平行6份，分别精密加入槲皮素对照品0.62 mg和山柰酚对照品3.2 mg，按“2.3”项下的制备方法进行处理并按 “2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率，测得量带入 “2.4”项下线性方程中，显示在线性范围内，结果见表1。

2.9 样品测定 精密称取胡颓子叶样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按 “2.1”项下色谱条件测定，用外标法计算各样品中槲皮素和山奈酚的含有量，结果见表2。

3 提取条件的优化

3.1 单因素试验

3.1.1 提取方法的考察 精密称取胡颓子叶 （江苏）粉末1 g，精密加入25%盐酸-乙醇 （1∶4）100 mL，称定质量，分别采用超声提取30 min和回流提取1.5 h进行实验，放置至室温，称定质量，用乙醇补足减失质量，滤过，取续滤液。结果显示超声提取得到的槲皮素和山柰酚含有量明显较低，而回流提取得到含有量较高的槲皮素和山柰酚，故采用回流提取方法。

表1 加样回收率试验 （n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2 样品测定结果 （mg/g）Tab.2 Determ ination results of sam p les（mg/g）

3.1.2 提取溶剂的考察 精密称取胡颓子叶 （江苏）粉末1 g，精密加入25%盐酸-85%乙醇 （1∶4）、25%盐酸-乙醇 （1∶4）、25%盐酸-85%甲醇（1∶4）、25%盐酸-甲醇 （1∶4）各100 mL，称定质量，回流提取1.5 h，放置至室温，称定质量，用不同比例的溶剂补足减失的质量，滤过，取续滤液。结果表明用25%盐酸-乙醇 （1∶4）提取所得的槲皮素和山柰酚的含有量较高，色谱峰分离度好，故选择用25%盐酸-乙醇 （1∶4）作为提取溶剂。

3.2 正交试验

3.2.1 正交试验设计及分析 在单因素试验的基础上，以槲皮素和山柰酚的含有量为考察指标，采用L9（34）正交表安排实验，考察提取溶剂、体积、时间、次数这4个因素。精密称取胡颓子叶（江苏）粉末9份，每份1g。因素水平见表3。

表3 正交试验因素水平Tab.3 Orthogonal test factors and levels

采用综合评分法和正交软件进行数据处理，得出提取溶剂和溶剂体积有极显著性，提取时间和次数无显著性，故最优提取条件为A3B3C1D1。

3.2.2 正交试验验证 以优化提取条件A3B3C1D1重复实验3次，结果表明所选提取工艺条件槲皮素和山柰酚含有量平均值均比正交最高值高，故最终确定最佳提取条件为A3B3C1D1。

4 结果与讨论

4.1 检测波长的选择 考察了波长在360 nm和366 nm下的出峰情况，在366 nm下所测得的峰面积比360 nm处所测得的峰面积大，检测灵敏度高，且基线平稳，故选择366 nm为测定波长。

4.2 柱温的选择 考察了不同柱温 （20、25、30、35、40℃）对槲皮素和山柰酚分离效果的影响，结果显示柱温在30℃时，槲皮素和山柰酚的分离效果均较好。

4.3 测定结果分析 由表2可以看出，贵州的胡颓子叶统货药材中槲皮素的含有量最高，安徽产地含有量最低；蕲春产地胡颓子叶中山柰酚的含有量最高，安徽产地的含有量最低。结果显示，这可能和药材的品种差异、产地环境、气候温度、生长方式、采摘时间等因素有密切关系。本结果对规范胡颓子叶的栽培管理，提高胡颓子叶的质量具有一定的意义和价值。

［1］李 聪，葛月宾，胡 婧，等.HPLC法测定胡颓子叶中山柰素的含量［J］.中国药房，2012，23（19）：1772-1774.

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Assay of quercetin and kaem pferol in leaves of Elaeagnus pungens by HPLC

HUANG Li-jie， CUIYong-xia， LIUWei*， ZHANGWei-xin， LIN Shuai-jun， LISui
（Analysis and Testing Center，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Elaeagnus pungens；quercetin；kaempferol；HPLC

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1302-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.031

2014-09-04

河南省科技攻关项目 （102102310089）

黄丽杰 （1988—），女，硕士生，从事现代仪器分析方法在药物质量标准研究中的应用研究。

*通信作者：刘 伟 （1955—），男，教授，长期从事中药质量标准和仪器分析方法的研究。Tel： （0371）65575838，E-mail：hnliuwei2088@sina.com