补骨脂和肉豆蔻炮制对脾肾阳虚泄泻大鼠能量代谢的影响

陈志敏， 胡昌江， 潘 新， 赵 玲， 熊 瑞， 耿媛媛， 胡 麟

（成都中医药大学药学院，四川成都611137）

补骨脂和肉豆蔻炮制对脾肾阳虚泄泻大鼠能量代谢的影响

陈志敏， 胡昌江*， 潘 新， 赵 玲， 熊 瑞， 耿媛媛， 胡 麟

（成都中医药大学药学院，四川成都611137）

目的从能量代谢角度比较二神丸中补骨脂、肉豆蔻炮制前后对脾肾阳虚泄泻大鼠的调控效应。方法采用腺嘌呤灌胃，饮食失节，服冰番泻叶水浸剂方法复制脾肾阳虚泄泻大鼠模型，给药二神丸进行治疗性实验，酶标仪法检测大鼠肝组织中Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase以及乳酸脱氢酶（LDH）活性变化；比色法检测肝组织中琥珀酸脱氢酶（SDH）活性变化。结果与正常对照组比较，模型组肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性显著降低 （P＜0.01）；LDH活性显著升高 （P＜0.01）。与模型组相比较，二神丸Ⅳ组 （盐炙补骨脂+麸煨肉豆蔻）Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性明显升高，LDH活性明显降低，均具有极显著性差异（P＜0.01）；与二神丸Ⅰ组（补骨脂生品+肉豆蔻生品）相比较，二神丸Ⅳ组Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性均高于二神丸Ⅰ组，差异有统计学意义 （P＜0.05）；LDH低于二神丸Ⅰ组，差异有统计学意义 （P＜0.05）。结论经盐炙补骨脂和麸煨肉豆蔻组方的二神丸改善脾肾阳虚泄泻模型大鼠能量代谢效果更加明显，提示其增效可能与促进能量代谢相关酶活性有关。

二神丸；补骨脂；肉豆蔻；炮制；能量代谢；ATP；琥珀酸脱氢酶；乳酸脱氢酶

二神丸出自宋·许叔微的《普济本事方》，以补骨脂和肉豆蔻组成，具有温肾暖脾、涩肠止泻之功效，临床上常用于脾肾阳虚之肾泄证，亦称“五更泄”、“鸡鸣泻”。方中补骨脂辛苦性温，补命门之火以温养脾土，为君药；以肉豆蔻温中涩肠为臣药，与补骨脂相伍，既可增强温肾暖脾之力，又能涩肠止泻。在前期研究中已经证明二神丸复方中补骨脂、肉豆蔻分别经盐炙和麸煨后组方入药能增强固涩止泻的作用［1-2］，但方中药物炮制前后对于 “五更泻”的作用机制目前尚无研究。

现代研究表明，脾肾阳虚会造成机能减弱或衰退、代谢减缓、产热不足的病理状态，患者常出现畏寒肢冷、精神不振、喜静萎靡等症状，与现代医学理论中的基础代谢率及能量代谢水平下降而导致的供能不足所表现的症状相似［3-5］。本实验将补骨脂、肉豆蔻纳入二神丸，从能量代谢的角度，以产热低下、代谢减缓为切入点，借助脾肾阳虚泄泻模型，对补骨脂、肉豆蔻炮制前后组方进行探讨，为二神丸中药物炮制增效的机理以及今后中医临证处方正确选用炮制品提供一定的理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雄性，体质量200～220 g，由四川达硕动物实验中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2013-24。

1.2 实验仪器 电子天平 （赛多利斯科学仪器（北京）有限责任公司）；TGL-16B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪（美国Thermo公司）

1.3 实验药物与试剂 补骨脂和肉豆蔻均购于成都市荷花池药材市场，经成都中医药大学卢先明教授鉴定分别为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实和肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥种仁。番泻叶，购于四川千方中药饮片有限公司，批号20130101。

腺嘌呤购于成都贝斯特试剂有限公司，批号D110160；Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、琥珀酸脱氢酶 （SDH）测试盒，购自南京建成生物工程研究所，批号 20140404；乳酸脱氢酶（LDH）测试盒、考马斯亮蓝蛋白定量测试盒，购自南京建成生物工程研究所，批号20140408。

2 实验方法

2.1 药物炮制及药液的制备

2.1.1 盐炙补骨脂 取补骨脂药材，加入药材量一半的食盐水（质量浓度为0.02 g/m L），室温闷润24 h，于150℃炒制10 min后置托盘中于50℃鼓风烘箱中烘干。

2.1.2 麸煨肉豆蔻 取肉豆蔻生品与麦麸 （100 g∶40 g）同置锅内，文火加热，温度控制在130～150℃，翻炒20 min，至麦麸呈焦黄色，肉豆蔻呈棕褐色。

2.1.3 番泻叶水浸剂 冷水浸1 h，后加水煮沸约10 min后过滤，减压浓缩成1.0 g/mL的药液。

2.1.4 二神丸药液 补骨脂和肉豆蔻的量按 《中药大辞典 （方剂分册）》中的2∶1比例配比，即补骨脂生品+肉豆蔻生品 （100 g∶50 g）、补骨脂生品+麸煨肉豆蔻 （100 g∶50 g）、盐炙补骨脂+肉豆蔻生品 （100 g∶50 g）、盐炙补骨脂+麸煨肉豆蔻 （100 g∶50 g），粉碎成粗粉，醇水双提 （先用8倍量的75%的乙醇回流提取1.5 h，过滤，药渣用8倍量的75%的乙醇回流提取1 h，过滤，药渣用10倍量的水回流提取1 h，过滤，药渣用10倍量的水回流提取0.5 h，合并滤液）后浓缩配制成质量浓度0.35 g/m L药液。

2.2 动物分组及模型制备 将48只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、二神丸Ⅰ组 （补骨脂生品+肉豆蔻生品）、二神丸Ⅱ组 （盐炙补骨脂+肉豆蔻生品）、二神丸Ⅲ组 （补骨脂生品+麸煨肉豆蔻）、二神丸Ⅳ组 （盐炙补骨脂+麸煨肉豆蔻）共6组。除正常对照组之外，其余各组均按以下方法进行复合造模：腺嘌呤200 mg/kg剂量，用前配制成悬浊液 （2 g/100 mL生理盐水），灌胃4周致肾阳虚；单日、双日交替喂饲甘蓝 （10g/只）和精炼猪油（2 mL/只）致饮食失节，附以每日下午游泳致劳倦过度以伤脾气，从第3周起在之前造模基础上再通过给予灌服冰番泻叶水浸剂，以1 mL/100 g体质量剂量灌胃2周达以伤脾阳［6-9］。同时第3周起 “二神丸”各组均按3.5 g/kg剂量，连续灌胃给药2周。

经过上述方法造模后大鼠出现饮水摄食量减退，活动减少，体质量减轻，体毛枯疏、失去光泽，大便溏泄、尿量增多，倦怠嗜卧，体温下降、畏寒蜷缩喜扎堆，个别动物出现脱肛，甚至死亡等一系列与类似中医 “脾肾阳虚”状态［10］，并且在造模第2周起出现稀便，第3周出现溏泄；此外，该复合造模方法实验室前期研究结果显示造模后大鼠血清cAMP下降，cGMP上升，cAMP/cGMP比值明显下降，差异有统计学意义 （P＜0.01），表明脾肾阳虚泄泻大鼠模型造模成功。实验共进行4周，结束次日处死并取样 （取样前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，颈部脱臼处死，迅速剖开腹腔取出肝组织。）。

2.3 肝组织匀浆的制备及蛋白定量 参照南京建成组织匀浆上清液制备实验方法学。实验之前将生理盐水预冷，用生理盐水快速洗尽组织上血液后，用滤纸将其拭干。准确取肝组织称定质量，按质量（g）∶体积 （mL）=1∶9的比例，冰袋上快速地剪碎组织块后倒入玻璃匀浆器中，冰水浴条件下匀浆，2 500 r/min离心10 min。取上清液（即10%的匀浆上清液），再用生理盐水10倍稀释成1%。肝组织匀浆按照考马斯亮蓝蛋白定量测试盒说明书进行蛋白定量，蛋白质量浓度=（测定管OD值-对照管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×对照品质量浓度 （0.563 g/L）。

2.4 肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性变化 按ATPase试剂盒说明书要求进行规范化操作，用酶标仪测定吸光度。再根据公式计算，ATPase活力=（测定管OD值-对照管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（0.02μmol/mL）×反应体系中样本稀释倍数× 6÷匀浆蛋白浓度。

2.5 肝组织SDH、LDH活性变化 按照SDH测试盒说明书要求进行规范化操作，用分光光度计在600 nm处比色，分别读取反应5 s、65 s时的吸光光度值（OD5 s、OD65 s），再根据公式计算，组织中SDH活性=［OD5s-OD65s）/0.01］/［反应时间min×（取样量mL×匀浆蛋白浓度）］；

按照LDH测试盒说明书要求进行规范化操作，用酶标仪测定吸光度。再根据公式计算，组织中LDH活性=（测定管OD值-对照管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准管浓度（0.2μmol/mL）÷匀浆蛋白浓度。

2.6 统计方法 采用Spss 19.0统计软件做数据处理，计量资料以 （x±s）表示。采用单因素方差分析，以P＜0.05时认为有统计学意义。

3 实验结果

3.1 肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性变化 与正常对照组相比较，模型组大鼠Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性显著降低（P＜0.01），表明机体处于供能不足、能量代谢低下、代谢紊乱，这与模型大鼠的状态相符，给药二神丸能提高Na+-K+-ATPase与Ca2+-Mg2+-ATPase活性，从而促进ATP的分解，保持细胞内外正常的离子浓度和膜电位，调节机体能量代谢。在二神丸四个组合中，以二神丸Ⅳ组相对于其他组效果最佳 （具体结果见表1）。

表1 各组大鼠肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-M g2+-ATPase活性的比较（U/mgprot）（x±s）Tab.1 Comparison of the Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in rats liver among different groups（U/mgprot）（x±s）

3.2 肝组织SDH、LDH活性变化 与正常对照组相比较，模型组大鼠SDH活性降低，LDH活性明显升高，二者均有极显著性差异 （P＜0.01），说明机体有氧氧化供能不足，能量代谢低下。给药二神丸后，大鼠SDH活性升高，LDH水平下调，从而改善机体细胞的能量代谢，使肝脏维持正常的代谢功能，机体处于代谢旺盛状态，且在四种组方中二神丸Ⅳ组效果更好 （具体结果见表2）。

4 讨论

二神丸是临床治疗五更泄泻的基础方，其病机在于脾肾阳虚。补骨脂盐炙后可引药入肾，增强温肾助阳、纳气止泻的作用，现代研究表明，补骨脂炮制后，补骨脂素和异补骨脂素含有量降低，但其吸收明显增加［11］，与 “肾”关系密切的微量元素Mn、Ca、Mg、Fe、Zn含有量增加［12］；肉豆蔻煨制可增强固肠止泻的作用，研究表明煨制后肉豆蔻中甲基丁香酚、甲基异丁香酚等是其挥发油止泻的主要有效成分，经过炮制后这两种成分明显增加［13］。Ca、Mg、Zn等微量元素在免疫调节和能量代谢方面起着重要作用，并且炮制后有效成分及吸收速率的增加也能增强疗效，但这些研究多局限于单味药，鲜有基于复方的研究。因此本实验将补骨脂和肉豆蔻的生品和其炮制品组合配方，得到4个组，以 “脾肾阳虚泄泻”大鼠模型为研究对象进行考察。

表2 各组大鼠肝组织SDH、LDH活性的比较（U/mgprot）（x±s）Tab.2 Com parison of the SDH and LDH activity in rats liver am ong different groups（U/mgp rot）（x±s）

实验结果显示，经复合因素造模后模型大鼠肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性显著降低，LDH水平升高，表明模型大鼠发生能量代谢的紊乱，给药二神丸后，上述指标均较模型组有所改善，使机体能量代谢处于活跃状态，且二神丸Ⅳ组的作用优于其他3组，说明 “二神丸”中补骨脂和肉豆蔻分别经过盐炙和煨炙后对脾肾阳虚的治疗效果最好。

本实验从能量代谢角度，阐明了二神丸中补骨脂、肉豆蔻炮制前后组方入药对 “五更泻”本质脾肾阳虚的影响。提示二神丸能提高脾肾阳虚大鼠低下的能量代谢水平，尤以补骨脂、肉豆蔻均炮制后组方入药效果更佳，因此临床上在治疗脾肾阳虚之肾泄证时，应以盐炙补骨脂和煨制肉豆蔻入药更好。

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Effect of processed Buguzhi and Roudoukou on energy metabolism in rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea

CHEN Zhi-min， HU Chang-jiang*， PAN Xin， ZHAO Ling， XIONG Rui， GENG Yuan-yuan，HU Lin
（College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

AIMTo compare the effects of after and before processing of Buguzhi（Psoraleae Fructus）and Roudoukou（Myristicae Semen）which comprised Ershen Pills on rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea from the viewpoint of energeticmetabolism.METHODSThe ratsmodels for the spleen-kidney yang deficiency diarrheaweremade through the perfusion of adenine，irregular diet，and reception of ice senna extract.Themodels were treated with Ershen Pills.The activity of Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and lactate dehydrogenase（LDH）in the liver tissue weremeasured by enzyme-linked immunosorbantassay.And the activity of succinate dehydrogenase（SDH）was observed by the colorimetric method.RESULTSIn comparison to the normal control group，processed Buguzhi and Roudoukou expressed a lower level of Na+-K+-ATPase（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATPase（P＜0.01）and SDH（P＜0.01），and a higher level of LDH（P＜0.01）in model group.Compared with themodel group，the Ershen PillsⅣgroup could enhance the level of Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and SDH activity，decrease the level of LDH activity.There were extremely significant differences（P＜0.01）. The Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and SDH activity in Ershen PillsⅣgroup were higher than those in Ershen PillsⅠgroup，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The LDH activity in Ershen PillsⅣgroup was lower than that in Ershen PillsⅠgroup，the difference was also statistically significant（P＜0.05）.CONCLUSIONErshen Pills，consisting of salt-frying Buguzhiand bran-roasting Roudoukou，has the function of improving the energetic metabolism of rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea，which may be related to relevant enzymes.

Ershen Pills；Buguzhi（Psoraleae Fructus）；Roudoukou（Myristicae Semen）；processing；energetic metabolism；ATP；SDH；LDH

R283.1

：A

：1001-1528（2015）06-1298-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.030

2014-07-10

国家自然科学基金面上项目 （81274085）

陈志敏 （1990—），硕士生，主要从事中药炮制与制剂研究。Tel：15281087650，E-mail：346578767@qq.com。

*通信作者：胡昌江 （1952—），教授，博士生导师，主要从事中药炮制学的教学和科研。Tel：13980980796，E-mail：hhccjj@hotmail.com