DART-Orbitrap质谱法快速定性定量分析延胡索

王 洋， 李乐乐， 李 波， 郭云龙， 刘淑莹，2*

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林长春130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林长春130022）

DART-Orbitrap质谱法快速定性定量分析延胡索

王 洋1， 李乐乐1， 李 波1， 郭云龙1， 刘淑莹1，2*

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林长春130117；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林长春130022）

目的建立一种对延胡索进行快速简便的定性鉴别和定量检测方法。方法采用DART-Orbitrap质谱法进行检测，对延胡索中的化学成分进行对照品比对和二级质谱确证，采用Full MS-SIM/Targeted-MS2扫描方式采集信号，并对延胡索乙素母离子和子离子的提取离子流图积分。结果在延胡索中检测出延胡索甲素和乙素的质子化离子峰，m/z分别为356.18和370.20，定量方法具有良好精密度和稳定性，延胡索乙素的线性范围为0.106～0.848μg/mL，r=0.997 0，平均加样回收率114.1%。结论该方法定量分析时快速精确，并且定性鉴别时无需对样品进行前处理。

：实时直接分析（DART）；Orbitrap质谱；延胡索；定性定量分析

实时直接分析（direct analysis in real time，DART）离子源是一种新型的敞开式大气压电离技术，在2005年由 Cody等［1］首次提出，同年由JOEL和IonSense公司将其商业化。这种电离技术不需要对样品进行复杂的前处理，能在几秒钟时间内分析存在于气体、液体、固体或材料表面的化合物，对样品消耗量较低，而且分析过程中不需要引入大量的有机溶剂。DART可以与多种质谱仪相联，如飞行时间质谱［2-3］、四级杆质谱［4］、离子阱质谱［5］等，可应用于食品安全［6-7］、 爆炸物检测［8］、药品非法添加等方面［9-10］，但是在中药材快速定性和定量方面的应用相对较少［11-13］。

传统中药材鉴定方法包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定四大类，各种方法都有其特点和适用对象，有时候还需要几种方法配合才能完成对一种中药材的准确鉴定。在 《中国药典》中关于中药材的鉴别项下，常用的鉴别方法是薄层色谱法，该方法操作繁琐，浪费时间，过程中需要大量有机溶剂，污染环境。因此非常有必要建立一种原位、快速、绿色的鉴定中药的方法。

本研究以延胡索药材为代表，利用DART-Orbitrap质谱技术对其进行检测，并对实验参数进行优化，建立了一种原位、简便、快速、绿色的中药材定性定量的方法。

1 仪器与材料

DART离子源 （包括自动滑轨、载样熔点管、十孔载样器、载样筛网，美国Ion Sense公司）；QExactive Orbitrap质谱仪（Xcaliber工作站，美国赛默飞世尔公司）。甲醇 （色谱纯，美国TEDIA公司）；高纯氮气、氦气 （纯度＞99.999%，长春巨洋氧气厂）；延胡索乙素 （北京北纳创联生物技术研究院，批号130828）；延胡索药材由长春中医药大学中药鉴定实验室提供。

2 方法与参数

2.1 检测条件

2.1.1 DART条件 离子化气体为氦气；待机气体为氮气；气体压力为0.5 MPa；气体温度为300℃；其他参数采用仪器默认设置；采用筛网进样方式；载样器滑动速度为0.2 mm/s；正离子模式采集。

2.1.2 Orbitrap质谱条件 扫描范围m/z50～750；分辨率为35 000；AGC target 1×10-6；正离子模式；扫描方式为Full MS-SIM/Targeted-MS2；碎裂电压NCE为35；DART离子源与质谱仪入口之间的距离为1 cm。

2.2 样品制备 精密配制1 mg/mL的延胡索乙素对照品溶液，作为贮备液。精密称取延胡索粉末2 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取10 min，放冷，用甲醇补足至刻度线，混匀，离心（12 000 r/min，10 min），取上清液作为供试品，即得。用熔点管蘸取样品溶液置于氦气流中检测，或者用移液枪吸取样品点在载样筛网上，每次检测时间为6 s，每个样品重复检测3次。

3 结果和讨论

3.1 氦气温度的选择 DART离子源工作气体和温度是影响离子化效果和信号强弱的主要因素，也是DART方法开发时应该重点考虑的参数。本实验选取了DART研究中最常用的两种气体氮气和氦气分别进行测试，结果发现，高纯氦气作为工作气体时，离子峰的强度和检测限明显优于氮气，这与文献［11］报道一致，所以选择高纯氦气作为DART的工作气体。

同时，我们也对工作气体的温度进行了优化，选用 《中国药典》规定的延胡索乙素为指标，结果如图1（A）所示。温度从50℃升高到450℃，温度间隔为50℃，在100℃下可以观测到质子化的延胡索乙素m/z356.18［M+H］+，但是背景干扰较大，信噪比较低。随着温度升高，m/z356.18的强度逐渐增大，当温度到达300℃时，强度趋于平稳，至450℃时保持恒定。有文献［11］报道，高温可能导致样品分解或焦化，因此本实验选择300℃作为检测的温度。

图1 延胡索乙素离子强度随温度的变化曲线（A）和其在300℃时的DART-M S谱图（B）Fig.1 Signal intensity of tetrahydropalmatine ion on different helium gas tem peratures（A）and DART mass spectrum of tetrahydropalmatine at 300℃（B）

3.2 扫描方式的选择 本实验对比了Full MSSIM/Targeted-SIM和Full MS-SIM/Targeted-MS2两种扫描方式。在Full MS-SIM/Targeted-SIM中，利用质子化延胡索乙素的精确相对分子质量，对总离子流图进行提取，并对其峰面积积分；在Full MSSIM/Targeted-MS2中，对m/z 356.18进行串联（图2A），得到m/z192.10碎片离子，在定量时选择m/z356.18和m/z192.10对总离子流图进行提取，并对提取离子流图的峰面积进行积分。以上两种扫描方式，在对延胡索对照品进行检测时差别不大，但是对延胡索药材检测时，由于药材中成分较多，会对检测结果造成一定干扰，因此本实验选择Full MS-SIM/Targeted-MS2扫描方式，以提高定量的准确度。

3.3 定性检测 熔点管蘸取延胡索提取液置于氦气流中，用DART-Orbitrap MS采集信号，结果如图3A所示。在质谱图中，可以看到有质子化的延胡索乙素峰 （m/z 356.181 0），另外还检测到了m/z370.159 3、m/z384.176 2、m/z322.103 1和m/z342.165 4。通过对比精确相对分子质量，确定m/z370.159 3为延胡索甲素，我们对m/z 356和m/z 370进行碎裂，碎裂机理如图3所示。同时，本实验还对延胡索药材进行直接检测，检测结果如图3B所示。得到的质谱图与延胡索提取液谱图一样，尽管背景干扰较大，信号强度较低，但是对于药材的定性鉴别来说影响不大。实验结果说明，DART-MS技术可以用来对延胡索进行定性检测，与传统的薄层色谱方法相比，具有速度快、节省有机溶剂、无需样品前处理等优点，另外多个指标同时定性还提高了结果的可信度。

图2 延胡索乙素 （A）和延胡索甲素 （B）的串联质谱图Fig.2 DART tandem m ass spectra of tetrahydropalm atine（A）and corydaline（B）

图3 延胡索提取液（A）和延胡索药材（B）的DART-MS谱图Fig.3 DARTmass spectra of extracting solution of Corydalis Rhizoma（A）and Corydalis Rhizoma medicinalmaterial（B）

3.4 定量检测 依据 《中国药典》中对延胡索药材的规定，本实验选取延胡索乙素作为定量检测的指标。同时，对载样方式进行优化。由于熔点管进样无法准确控制载样量，而筛网进样可以用移液枪进行控制，所以实验中选择筛网作为载样的方式。另外，对滑轨滑动速度进行优化时，发现如果以较快的速度进行滑动，筛网上的样品无法被完全离子化，影响方法的线性关系。通过对比，确定滑轨滑动的速度为0.2 mm/s。测定发现，该方法对延胡索乙素的检测限为10.6 ng。

3.4.1 精密度试验 取质量浓度为0.106μg/m L的对照品溶液5μL，点样至筛网上，按 “2.1”项下条件进行检测，重复测定6次，以延胡索乙素提取离子流图的峰面积计算。结果，RSD为4.3%，表明仪器的精密度良好。

3.4.2 重复性试验 取同一批次延胡索药材，按照 “2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，分别取5μL，点样至筛网上，按 “2.1”项下条件进行检测，以延胡索乙素提取离子流图的峰面积计算。结果，RSD为 5.3%，表明该方法重复性良好。

3.4.3 线性关系考察 精密吸取对照品贮备液适量，分别配制成质量浓度为 0.106、0.212、0.318、0.424、0.530、 0.636、0.742、 0.848 μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述对照品1μL，点样至筛网上，载样器滑动速度为0.2 mm/s，进行检测。以峰面积 （Y）和对照品质量浓度 （X）进行回归分析，得到延胡索乙素的回归方程为Y= 7.16×106X-2.43×108，r=0.997 0。结果表明，延胡索乙素在0.106～0.848μg/mL范围内线性关系良好。

3.4.4 回收率试验 取已测定含有量的同一批次延胡索药材，按照 “2.2”项下方法制备供试品溶液，分别吸取10μL供试品溶液5份，点样至载样筛网上，溶剂挥干后，再分别吸取0.106μg/m L的对照品溶液2μL点样于载样筛网上，将筛网置于滑轨上，测定延胡索乙素的量。结果，计算其回收率分别为119.0%、102.8%、99.1%、123.1%和126.7%，加样回收率的范围在99.1%～126.3%之间，平均加样回收率为114.1%。

4 结论

本实验建立了一种快速定性定量分析的方法，采用DART离子源结合高分辨Orbitrap质谱对延胡索进行检测，完成一次检测仅需要6 s。在定性鉴别时，无需对样品进行前处理，直接将药材置于电离区，通过质谱信号的精确相对分子质量进行定性鉴别。相比于常用的薄层色谱法，该方法具有操作简便、检测速度快、不需要引入有机试剂等特点，另外多种成分的同时定性提高了鉴别的准确性。在定量分析的准确度和重复性上，该方法相比于传统的色谱方法稍显逊色，但是其所具有的实时、快速、绿色和无需或者只需很小的样品前处理等优点，将在中药材或中成药的高通量筛查、快速定性鉴别、快速定量以及质量控制上显示出强大的优势。若能与小型便携式质谱结合，它定能更好地发挥其原位检测、现场检测和实时分析的优点。

［1］Cody R B，Laramée JA，Durst H D.Versatile new ion source for the analysis ofmaterials in open air under ambient conditions［J］.Anal Chem，2005，77（8）：2297-2302.

［2］Jagerdeo E，Abdel-Rehim M.Screening of cocaine and itsmetabolites in human urine samples by direct analysis in real-time source coupled to time-of-flight mass spectrometry after online preconcentration utilizing microextraction by packed sorbent［J］.JAm Soc Mass Spectr，2009，20（5）：891-899.

［3］Li Y J，Wang Z Z，Bi Y A，et al.The evaluation and implementation of directanalysis in real time quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry for characterization and quantification of geniposide in Re Du Ning Injections［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2012，26（11）：1377-1384.

［4］Rothenbacher T，Schwack W.Rapid and nondestructive analysis of phthalic acid esters in toysmade of poly（vinyl chloride）by direct analysis in real time single-quadrupolemass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23（17）：2829-2835.

［5］张佳玲，张 伟，周志贵，等.采用实时直接分析质谱法原位快速鉴别茶叶［J］.色谱，2011，29（7）：681-686.

［6］Hajslova J，Cajka T，Vaclavik L.Challenging applications offered by direct analysis in real time（DART）in food-quality and safety analysis［J］.Trac-Trend Anal Chem，2011，30（2）：204-218.

［7］Vaclavik L，Rosmus J，Popping B，et al.Rapid determination ofmelamine and cyanuric acid inmilk powder using direct analysis in real time-time-of-flightmass spectrometry［J］.JChromatogr A，2010，1217（25）：4204-4211.

［8］Nilles JM，Connell T R，Stokes S T，et al.Explosives detection using direct analysis in real time（DART）mass spectrometry［J］.Propell Explos Pyrot，2010，35（5）：446-451.

［9］程显隆，李文杰，李卫健，等.实时直接分析质谱法快速鉴别天然驱蚊产品中的人工添加剂［J］.药物分析杂志，2011，31（3）：438-442.

［10］Chernetsova E S，Morlock G E.Determination of drugs and drug-like compounds in different samp les with direct analysis in real timemass spectrometry［J］.Mass Spectrom Rev，2011，30（5）：875-883.

［11］Zhu H B，Wang C Y，Qi Y，et al.Rapid quality assessment of Radix Aconiti Preparata using direct analysis in real time（DART）mass spectrometry［J］.Anal Chim Acta，2012，752（8）：69-77.

［12］孙 磊，胡晓茹，刘丽娜，等.实时直接分析-串联质谱法快速检测吐根中的生物碱［J］.中国中药杂志，2012，37（10）：1426-1430.

［13］孙 磊，胡晓茹，金红宇，等.实时直接分析-串联质谱法快速分析乳香中多种乳香酸［J］.中草药，2012，43（7）：1320-1323.

Rapid qualitative and quantitative analysis of Corydalis yanhusuo by DART-Orbitrap mass spectrometry

WANG Yang1， LILe-le1， LIBo1， GUO Yun-long1， LIU Shu-ying1，2*
（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of ChineseMedicine，Changchun 130117，China；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022，China）

AIMTo establish a rapid and simple method for qualitative and quantitative analysis of Corydalis Rhizoma.M ETHODSDART-Orbitrap mass spectrometry was used to analyze the sample as compared withstandard sample.And the full scan spectra and secondary spectra were also adopted for the component identification.The fullMS-SIM/Targeted-MS2mode was applied to determining themass spectrum.Extract ion chromatography was used for quantitative analysis.RESULTSThe protonated molecule ion of corydaline and tetrahydropalmatine were observed in Corydalis Rhizoma based on the m/z356.18 and 370.20.The quantitative analysis demonstrated with good reproducibility，the linear of tetrahydropalmatine was in the range of 0.106-0.848μg/mL（r=0.9970），and the average recovery rate was 114.1%.CONCLUSIONThemethod is rapid and accuracy in the quantitative analysis，and does not need the pretreatment of samples in the qualitative analysis.

directanalysis in real time（DART）；Orbitrap mass spectrometry；Corydalis Rhizoma；qualitative and quantitative analysis

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1279-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.026

2014-08-07

国家自然科学基金项目 （21175127）

王 洋 （1986—），男，硕士，实习研究员，从事中药化学和代谢组学研究。Tel：（0431）86045256，E-mail：white-wing@ 163.com

*通信作者：刘淑莹（1943—），女，博士，研究员，博士生导师，从事质谱分析研究。E-mail：syliu@ciac.ac.cn