水貂大肠杆菌的分离·鉴定及药敏试验

孙蓉蓉，邹 玲，刘文华，张 灿，李文立，任慧英

(青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109)



水貂大肠杆菌的分离·鉴定及药敏试验

孙蓉蓉，邹 玲，刘文华，张 灿，李文立，任慧英*

(青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109)

[目的]为更好预防水貂大肠杆菌病提供依据。[方法]从山东某大型水貂养殖场采集病料，通过病原分离、培养特性、染色特性和生化试验等对病原进行分离与鉴定，并对分离菌进行药敏试验。[结果] 共分离致病菌18株，其中有10株为大肠杆菌，说明该养殖场主要的细菌病为大肠杆菌感染。药敏试验结果表明分离出的大肠杆菌对大多数抗菌药物敏感。[结论] 水貂发生细菌病后，应尽可能通过药敏试验筛选敏感药物，避免盲目投药。

水貂；大肠杆菌；分离；鉴定；药敏试验

水貂大肠杆菌病是水貂的一种肠道传染病，常呈败血型经过，伴有严重下痢，侵害呼吸器官，死亡率高[1]。自20世纪80年代以来，山东省水貂养殖场数量逐年增加。据海关贸易总署统计，全国平均年产水貂皮1 200万张，其中山东省占2/3。养殖水貂利润很高，是农民脱贫致富的有效途径，深受农民的欢迎[2]。由于养殖水貂的规模不断扩大，水貂抗病力逐年降低。条件性致病菌是继发水貂细菌病的主要病原，给水貂养殖业带来巨大的经济损失，也制约了水貂养殖业的进一步发展。

近年来，科研工作者对水貂病毒性疾病的研究较为深入，并且已经得到一定控制，而对水貂细菌性疾病的相关报道则很少。笔者通过对山东省威海市某大型养殖场的病料采集，分离并鉴定了10株水貂大肠杆菌，并对分离菌株进行了药敏试验，以期为更好地预防水貂大肠杆菌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源病料采自山东省威海市某水貂养殖场新鲜病死水貂。

1.2 主要试剂普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂(TSI)，均购自北京路桥技术有限公司；大肠杆菌显色培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；葡萄糖蛋白胨水、糖发酵管、西蒙氏枸橼酸盐琼脂、药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离无菌取病死水貂的肝脏，分别划线接种于普通营养琼脂、麦康凯琼脂培养基，37 ℃恒温培养24 h，观察细菌生长情况及菌落特征。

1.4 细菌的纯化及形态观察取初步分离的细菌，划线接种于麦康凯培养基及大肠杆菌显色培养基上，37 ℃恒温纯化培养24 h，挑选典型菌落在新鲜斜面上进行纯培养。挑取1环细菌的纯培养产物，按照常规方法进行革兰氏染色镜检。

1.5 生化鉴定

1.5.1糖类代谢试验。 挑取麦康凯培养基上的典型菌落，接种微量糖发酵管、三糖铁琼脂培养基，37 ℃条件下恒温培养24 h后观察结果。

1.5.2其他生化反应。 挑取麦康凯培养基上的典型菌落，按照常规方法进行吲哚试验、MR试验、VP试验及柠檬酸盐利用试验(合称IMViC试验)[3]。

1.6 纸片扩散法药敏试验将浓度为108CFU/ml的新鲜菌液涂布普通营养琼脂平板，放置5 min后将18种药敏纸片贴于平板表面，37 ℃条件下培养18 h后观察结果，按照CLSL标准进行药物敏感性评价[4]。

2 结果与分析

2.1 细菌培养结果从28份病料共分离出18株细菌。分离菌在普通琼脂培养基上形成圆形隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的灰白色菌落；其中，10株分离菌在麦康凯培养基上形成桃红色、光滑、中等大小的菌落。在大肠杆菌显色培养基上形成蓝绿色菌落。

2.2 形态及生化鉴定将各分离菌进行革兰氏染色并镜检，可见淡红色、短小的杆状细菌。各分离菌均可以分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，产酸产气，60%的菌株还利用蔗糖；三糖铁琼脂培养基上斜面和底层均产酸，变黄，产气，不产生硫化氢；IMViC试验结果为“+ + - -”。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》可知，上述分离菌均符合大肠杆菌的特性[5]，因此可以确定其为大肠杆菌。

2.3 药敏试验结果根据CLSI标准可知，10株大肠杆菌对不同药物的药敏纸片的抑菌情况如表1。从表1可以看出，10株水貂大肠杆菌分离株对18种抗生素均有不同程度耐药，其中环丙沙星、诺氟沙星、链霉素、四环素、氨苄西林5种抗菌药的耐药性都大于50%，而对头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟的耐药率为0。10株大肠杆菌分离株对18种抗生素的敏感性也有所不同，以头孢西叮、头孢他啶、头孢吡肟敏感率最高，达到100%。除1株大肠杆菌仅对四环素耐药(1耐)外，其他均为多耐菌株，其中2个2耐菌株，1个3耐菌株，1个4耐菌株，2个7耐菌株，1个9耐菌株，2个菌株同时对13种抗菌药物表现为耐药。

表1 药敏试验结果

抗菌药物敏感菌株数百分比∥%中介菌株数百分比∥%耐药菌株数百分比∥%头孢噻吩77000330头孢唑啉77000330头孢呋辛77000330头孢哌酮77033000头孢噻肟660110330头孢西叮101000000头孢曲松77000330头孢他啶101000000头孢吡肟101000000环丙沙星55000550诺氟沙星55000550左氧沙星66000440阿米卡星440440220链霉素110110880磷霉素88000220氯霉素440110440四环素11000990氨苄西林440110550

3 讨论

笔者对某大型养貂场进行了为期3个月的病料采集，共收集28次(份)病料，经实验室分离与鉴定，共获得10株大肠杆菌，分离率为35.7%，说明大肠杆菌是该养貂场的主要细菌病原，这与文献中的大肠杆菌病是水貂常发病的报道一致[6-8]。大多数大肠杆菌是人类和动物肠道中的共栖菌，但当细菌发生移位，入侵肠外组织，即成为条件性致病菌，另外，还有某些血清型的大肠杆菌是人类和动物的重要致病菌[9]。水貂大肠杆菌病的发病与饲养场内的饲养管理、饲料、环境卫生和气候变化等有密切的关系，因此，临床防治大肠杆菌病，水貂场应严格控制饲养管理，不能混群饲养，同时要严格管理饲养卫生，增强消毒意识，做到定期消毒, 减少环境中致病菌的含量，从而有效减少致病菌对水貂的侵害，气候剧变时可以适当使用药物预防。饲喂安全的饲料可以有效减少水貂大肠杆菌病的发生。对来源不明的动物性饲料，必须经高温加工后方可饲喂[10]。

此次分离的10株水貂大肠杆菌对头孢西叮、头孢他啶和头孢吡肟3种抗菌药物的敏感率为100%，对其他15种抗菌药物则表现为不同程度的耐药，有2株大肠杆菌可对13种药物同时耐药。多重耐药现象的出现与水貂细菌病防治中滥用抗菌药物有很大关系，许多养殖户不按照剂量及疗程给药治疗，或在饲料及饮水中长期添加抗菌药物进行疾病预防，都会造成耐药性提高。药敏试验结果表明，水貂发生细菌病后应尽可能通过药敏试验筛选敏感药物，避免盲目投药。

[1] 赵纯德，应祯灏，王林志，等.舟山市三起水貂大肠杆菌病的诊治报告[J].毛皮动物饲养,1989(4):22-24.

[2] 马利. 水貂养殖商机巨大[J]. 吉林畜牧兽医，2002(5)：27-28.

[3] 胡桂学.兽医微生物学实验教程[M].北京：中国农业大学出版社，2006:47-60.

[4] 杨沙沙,王喜仁,韩杰，等.美国CLSI抗菌药物敏感试验操作标准(2010年版)部分变更内容[J].中国感染控制杂志,2010(4):303-304.

[5] R E 布坎南.伯杰氏细菌鉴定手册[K].北京：科学出版社，1984.

[6] 曹荣峰,田洪宇,王继芳，等.水貂细菌性疾病的病原学调查[J].经济动物学报,2008,12(1):21-23.

[7] 张贵贤,史秋梅.水貂大肠杆菌病的诊断与防治[J].中国兽医杂志,2013,49(2):45-46.

[8] 邢兰君.水貂大肠杆菌病的诊断与治疗[J].兽药与饲料添加剂,2008,13(3):39.

[9] 李一经. 兽医微生物学[M].北京：高等教育出版社,2011.

[10] 倪金花.水貂大肠杆菌病的预防和治疗[J].养殖技术顾问,2014(1):170.

Isolation, Identification and Drug Sensitivity Test ofEscherichiacolifrom Minks

SUN Rong-rong, ZOU Ling, LIU Wen-hua, REN Hui-ying*et al

( College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao, Shandong 266109)

[Objective] The research aimed to provide basis for preventing the colibacillosis of minks. [Method] The diseased samples of minks were collected from a big mink farm in Shandong Province. The pathogens were isolated and identified by pathogen isolation, culture characteristics, staining characteristics and biochemical tests. And the sensitivity test was conducted on the isolated pathogens. [Result] 18 strains of pathogenic bacteria were isolated, including 10 strains ofEscherichiacoli. These results indicated thatE.coliwas the main bacterial pathogen in this farm. The results of that drug sensitivity test showed that the isolated strains ofE.coliwere sensitive to most antimicrobials. [Conclusion] When the bacteriosis of minks occurred, the sensitive drugs should be selected by drug sensitivity test to avoid drug abuse.

Mink;Escherichiacoli; Isolation; Identification; Drug sensitivity test

山东省现代农业产业技术体系毛皮动物产业创新团队项目(SDAIT-18-011-04)。

孙蓉蓉(1991-)，女，山东威海人，硕士研究生，研究方向：兽医微生物与免疫学。*通讯作者，教授，从事兽医微生物与免疫学方面的研究。

2015-03-12

S 852.6

A

0517-6611(2015)11-119-01