电化学分析方法检测黄瓜中残留的西维因

董晓娅+邱白晶+管贤平

摘要：基于氨基甲酸酯类农药抑制乙酰胆碱酯酶活性的原理，以硫化镉-石墨烯纳米复合物为酶固定化材料，以西维因作为模型化合物构建了基于乙酰胆碱酯酶的氨基甲酸酯类农药的生物传感平台。结果表明，固定在硫化镉-石墨烯纳米复合材料上的乙酰胆碱酯酶与氯化硫代乙酰胆碱的亲和能力强，并且硫化镉-石墨烯纳米复合材料上的乙酰胆碱酯酶对氯化硫代乙酰胆碱的催化活性高，其米氏常数Km为0.24mmol；由于硫化镉-石墨烯纳米复合材料的引入，增加了氯化硫代乙酰胆碱在电极表面的电子转移速度，提高了检测的灵敏度；该传感器对西维因的检测范围为2ng/mL～2μg/mL，检测限为0.72ng/mL，研究结果为氨基甲酸酯类农药的快速检测提供了一种有效的途径。

关键词：黄瓜；西维因；农药残留；电化学方法；生物传感平台

中图分类号：TQ450.2+63文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0337-02

农药在保护农作物、防治病虫草害、改善人类生存环境、控制疾病等方面发挥了巨大作用，因而农药的使用给人们带来了巨大的经济效益和社会效益，对人类生存起到了重要作用。但是随着农药使用范围的逐渐扩大和使用量的不断增加，逐渐暴露了其作为污染物的不足以及由此造成的众多环境及食物安全问题[1]。近年来，氨基甲酸酯类农药的广泛使用已经严重威胁到人类的健康以及环境和食品安全，并引起了社会的普遍关注，因此实现氨基甲酸酯类农药的快速和灵敏检测具有十分重要的意义[2]。

目前对农药中氨基甲酸酯类农药的检测方法主要包括气相色谱、高效液相色谱、薄层色谱、毛细管电泳、色谱-质谱联用技术、流动注射分析法等。这些方法均存在样品前处理复杂、仪器设备昂贵、分析费时长、要求熟练的技术人员才能完成等问题。因此，开发灵敏度高、方便快捷、准确安全、特异性强的检测新技术，实现对农药进行痕量检测已成为迫在眉睫的重要研究课题之一。电化学检测方法以其灵敏度高、速度快、花费低、危害低等优越性，已经在诸多的测定技术中脱颖而出[3]，并广泛应用于环境、医药、食品发酵等领域。电化学分析的另一特点是仪器简单，不受体系浊度和颜色影响，其安培检测信号与待测物质的浓度呈线性关系，因而可将检测信号转换为直观易读的浓度值，便于非专业人士使用[4]。本试验采用电化学方法对黄瓜中西维因的残留量进行分析，该方法简单、准确、重现性好，可以适用于农药的快速检测。

1材料与方法

1.1试验时间与地点

试验于2014年春季在江苏大学玻璃温室内进行。

1.2试验材料

以新津春四F1为试验对象，在黄瓜开花当天，用西维因喷洒花朵，进行正常田间管理。随机摘取花后6、8、10d的黄瓜，分别将其粉碎，各个样品随机称取20g并分别放入取样瓶中，加入30mL丙酮剧烈震动混匀，离心5min后取上清液，经过旋转蒸发仪浓缩蒸干，加入100mL磷酸盐缓冲液（PBS）。

西维因标准品、乙酰胆碱酯酶、氯化硫代乙酰胆碱，购于Sigma-Aldrich试剂公司；西维因水剂，购自当地市场；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司。

KQ-100型超声波清洗器，购于昆山市超声仪器有限公司；JB-1型搅拌器，购于上海雷磁仪器厂新泾分厂；ZENNIUM电化学工作站，购于德国Zahner公司；H1650离心机，购于湘仪离心机仪器有限公司。

1.3硫化镉-石墨烯纳米复合物的合成

通过改进的Hummers法[5]合成氧化石墨，以氧化石墨和硝酸镉为原料、以硫化氢为硫源和还原剂制备硫化镉-石墨烯纳米复合物。具体制备方法为：称取170mg所制得氧化石墨，将其加入到含有100mL蒸馏水的反应瓶中，超声30min；在磁力搅拌下向该悬浮液中缓慢加入500mL0.02mol/L硝酸镉溶液，常温下搅拌3h；然后向反应瓶中通入硫化氢气体，反应1h后将其离心分离，将所得纳米材料干燥后备用。

1.4修饰电极的构建

将直径为3.0mm的玻碳电极在使用前依次用1.0、0.3μm的三氧化二铝抛光粉在抛光布上抛成镜面，然后在无水乙醇中超声清洗1min，再用双蒸水超声清洗1min，用氮气吹干电极后在其表面滴涂5μL2mg/mL的硫化镉-石墨烯纳米复合物，室温晾干后将修饰的电极浸入含有10U/mL乙酰胆碱酯酶的0.1mol/LPBS（pH值7.4）中，置于4℃冰箱中10h，然后取出电极并清洗掉弱键合或弱吸附的酶分子，制成修饰电极。

1.5分析方法

电化学试验在德国ZENNIUM电化学工作站上进行，采用传统的三电极体系：修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极。循环伏安技术检测时，先将三电极体系插入含氯化硫代乙酰胆碱的PBS溶液中检测电流信号，然后将工作电极取出，在含有多菌灵的溶液中浸泡2min，接着把工作电极放回电解池中检测电流信号，根据电流前后的酶抑制效率，确定多菌灵的浓度。计时电流试验考察酶在电极上的活性时是在电磁搅拌下的PBS溶液中进行的，待加上操作电压，背景电流达到稳定值后，用微量注射器迅速加入一定浓度的氯化硫代乙酰胆碱溶液到电解池中，以相应的电流值作为氯化硫代乙酰胆碱的响应信号。所有测量试验均在室温25℃下进行。

2结果与分析

2.1硫化镉-石墨烯复合材料固定乙酰胆碱酯酶的酶催化活性

西维因对乙酰胆碱酯酶的酶抑制效率用以下公式计算：

酶抑制效率=（1-Ip，exp/Ip，control）×100%。

式中：Ip，control为氯化硫代乙酰胆碱在工作电极上的响应峰电流；Ip，exp为工作电极在酶被抑制后的响应峰电流。

以恒电位计时电流法研究酶的催化活性。由图1可以看出，随着氯化硫代乙酰胆碱浓度的不断增加，生物传感器的电流响应呈现出Michaelis-Menten特性，其表观Michaelis-Menten常数Km（表示酶对底物的亲和力）可由电化学Lineweaver-Burk方程[6]得到。由图2数据分析可知，吸附态乙酰胆碱酯酶的Km值为0.24mmol/L，比文献报道的吸附在纳米金溶胶-凝胶膜（0.45mmol/L）[7]和碳纳米管修饰膜（4.4mmol/L）[8]上乙酰胆碱酯酶的Km值小得多，说明吸附在硫化镉-石墨烯纳米复合膜电极上的乙酰胆碱酯酶对催化底物氯化硫代乙酰胆碱具有较高的亲和性和催化活性。endprint

2.2氨基甲酸酯类农药西维因检测方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰胆碱的PBS缓冲体系中作循环伏安曲线（图3-a），然后将工作电极分别经0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西维因（图3中分别标为b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰胆碱的溶液中作相应的循环伏安曲线，发现其氧化峰电流逐渐降低，并且随着西维因浓度的增大，其峰电流的降低值也增大，如图3中曲线b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯农药西维因对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用，可构建一种简单、有效的用于氨基甲酸酯类农药检测的电化学方法。

2.3标准曲线的绘制

准确配制不同浓度的西维因标准溶液，按照“1.5”节中的方法进行操作，以修饰电极在西维因标准溶液中浸泡前后的酶抑制效率为纵坐标，以西维因相应浓度的对数lg（西维因浓度）为横坐标绘制标准曲线，由图4可见，两者呈良好的线性关系，线性范围为2ng/mL～2μg/mL，检测限为0.72ng/mL。

2.4精密度测定

对同一样品重复测定8次，测其精确度，发现对西维因的检测标准偏差为0.76%，表明该方法的精密度良好。

2.5准确度测定

准确取3份10mL西维因浸提液，分别加入一定含量的西维因标准品，按样品测定方法进行测定，计算回收率，其结果见表1，可见检测回收率在98.5%～101.3%之间。结果表明，该方法准确度高，符合农药检测要求。

2.6西维因在黄瓜中的残留分析

分别于6、8、10d对花期经过西维因处理过的黄瓜取样，并进行电化学分析，均未检出西维因。

3结论

以硫化镉-石墨烯纳米复合物作为乙酰胆碱酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯类农药对固定在硫化镉-石墨烯纳米复合物上乙酰胆碱酯酶的抑制作用，构建了一种快速、灵敏的安培型氨基甲酸酯类农药的生物传感器。结果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范围内，乙酰胆碱酯酶的抑制率与西维因浓度的对数呈良好的线性关系，其检测下限可达0.72ng/mL，说明该传感器具有较高的精密度和准确度。

参考文献：

[1]伍小红，李建科，惠伟.农药残留对食品安全的影响及对策[J].食品与发酵工业，2005，31（6）：80-84.

[2]崔洪力，李强，刘美良.农药残留及监控对策[J].农业与技术，2002，22（5）：74-76.

[3]SerraB，MoralesMD，ZhangJB，etal.In-a-dayelectrochemicaldetectionofcoliformsindrinkingwaterusingatyrosinasecompositebiosensor[J].AnalyticalChemistry，2005，77（24）：8115-8121.

[4]Tran-MinhC，PandeyPC，KumaranS.Studiesonacetylcholinesensoranditsanalyticalapplicationbasedontheinhibitionofcholinesterase[J].Biosensors&Bioelectronics，1990，5（6）：461-471.

[5]HummersJrWS，OffemanRE.Preparationofgraphiticoxide[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1958，80（6）：1339.

[6]DuD，ChenWJ，CaiJ，etal.DevelopmentofacetylcholinesterasebiosensorbasedonCdTequantumdotsmodifiedcysteamineself-assembledmonolayers[J].JournalofElectroanalyticalChemistry，2008，623（1）：81-85.

[7]DuD，ChenSZ，CaiJ，etal.ImmobilizationofacetylcholinesteraseonGoldnanoparticlesembeddedinsol-gelfilmforamperometricdetectionoforganophosphorousinsecticide[J].Biosensors&Bioelectronics，2007，23（1）：130-134.

[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint

2.2氨基甲酸酯类农药西维因检测方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰胆碱的PBS缓冲体系中作循环伏安曲线（图3-a），然后将工作电极分别经0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西维因（图3中分别标为b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰胆碱的溶液中作相应的循环伏安曲线，发现其氧化峰电流逐渐降低，并且随着西维因浓度的增大，其峰电流的降低值也增大，如图3中曲线b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯农药西维因对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用，可构建一种简单、有效的用于氨基甲酸酯类农药检测的电化学方法。

2.3标准曲线的绘制

准确配制不同浓度的西维因标准溶液，按照“1.5”节中的方法进行操作，以修饰电极在西维因标准溶液中浸泡前后的酶抑制效率为纵坐标，以西维因相应浓度的对数lg（西维因浓度）为横坐标绘制标准曲线，由图4可见，两者呈良好的线性关系，线性范围为2ng/mL～2μg/mL，检测限为0.72ng/mL。

2.4精密度测定

对同一样品重复测定8次，测其精确度，发现对西维因的检测标准偏差为0.76%，表明该方法的精密度良好。

2.5准确度测定

准确取3份10mL西维因浸提液，分别加入一定含量的西维因标准品，按样品测定方法进行测定，计算回收率，其结果见表1，可见检测回收率在98.5%～101.3%之间。结果表明，该方法准确度高，符合农药检测要求。

2.6西维因在黄瓜中的残留分析

分别于6、8、10d对花期经过西维因处理过的黄瓜取样，并进行电化学分析，均未检出西维因。

3结论

以硫化镉-石墨烯纳米复合物作为乙酰胆碱酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯类农药对固定在硫化镉-石墨烯纳米复合物上乙酰胆碱酯酶的抑制作用，构建了一种快速、灵敏的安培型氨基甲酸酯类农药的生物传感器。结果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范围内，乙酰胆碱酯酶的抑制率与西维因浓度的对数呈良好的线性关系，其检测下限可达0.72ng/mL，说明该传感器具有较高的精密度和准确度。

参考文献：

[1]伍小红，李建科，惠伟.农药残留对食品安全的影响及对策[J].食品与发酵工业，2005，31（6）：80-84.

[2]崔洪力，李强，刘美良.农药残留及监控对策[J].农业与技术，2002，22（5）：74-76.

[3]SerraB，MoralesMD，ZhangJB，etal.In-a-dayelectrochemicaldetectionofcoliformsindrinkingwaterusingatyrosinasecompositebiosensor[J].AnalyticalChemistry，2005，77（24）：8115-8121.

[4]Tran-MinhC，PandeyPC，KumaranS.Studiesonacetylcholinesensoranditsanalyticalapplicationbasedontheinhibitionofcholinesterase[J].Biosensors&Bioelectronics，1990，5（6）：461-471.

[5]HummersJrWS，OffemanRE.Preparationofgraphiticoxide[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1958，80（6）：1339.

[6]DuD，ChenWJ，CaiJ，etal.DevelopmentofacetylcholinesterasebiosensorbasedonCdTequantumdotsmodifiedcysteamineself-assembledmonolayers[J].JournalofElectroanalyticalChemistry，2008，623（1）：81-85.

[7]DuD，ChenSZ，CaiJ，etal.ImmobilizationofacetylcholinesteraseonGoldnanoparticlesembeddedinsol-gelfilmforamperometricdetectionoforganophosphorousinsecticide[J].Biosensors&Bioelectronics，2007，23（1）：130-134.

[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint

2.2氨基甲酸酯类农药西维因检测方法的可行性

在含有1mmol/L氯化硫代乙酰胆碱的PBS缓冲体系中作循环伏安曲线（图3-a），然后将工作电极分别经0.002、0.01、0.02、0.1μg/mL的西维因（图3中分别标为b、c、d、e）抑制2min后，在含有氯化硫代乙酰胆碱的溶液中作相应的循环伏安曲线，发现其氧化峰电流逐渐降低，并且随着西维因浓度的增大，其峰电流的降低值也增大，如图3中曲线b、c、d、e所示，因而基于氨基甲酸酯农药西维因对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用，可构建一种简单、有效的用于氨基甲酸酯类农药检测的电化学方法。

2.3标准曲线的绘制

准确配制不同浓度的西维因标准溶液，按照“1.5”节中的方法进行操作，以修饰电极在西维因标准溶液中浸泡前后的酶抑制效率为纵坐标，以西维因相应浓度的对数lg（西维因浓度）为横坐标绘制标准曲线，由图4可见，两者呈良好的线性关系，线性范围为2ng/mL～2μg/mL，检测限为0.72ng/mL。

2.4精密度测定

对同一样品重复测定8次，测其精确度，发现对西维因的检测标准偏差为0.76%，表明该方法的精密度良好。

2.5准确度测定

准确取3份10mL西维因浸提液，分别加入一定含量的西维因标准品，按样品测定方法进行测定，计算回收率，其结果见表1，可见检测回收率在98.5%～101.3%之间。结果表明，该方法准确度高，符合农药检测要求。

2.6西维因在黄瓜中的残留分析

分别于6、8、10d对花期经过西维因处理过的黄瓜取样，并进行电化学分析，均未检出西维因。

3结论

以硫化镉-石墨烯纳米复合物作为乙酰胆碱酯酶的固定化材料，基于氨基甲酸酯类农药对固定在硫化镉-石墨烯纳米复合物上乙酰胆碱酯酶的抑制作用，构建了一种快速、灵敏的安培型氨基甲酸酯类农药的生物传感器。结果表明，在2ng/mL～2μg/mL的范围内，乙酰胆碱酯酶的抑制率与西维因浓度的对数呈良好的线性关系，其检测下限可达0.72ng/mL，说明该传感器具有较高的精密度和准确度。

参考文献：

[1]伍小红，李建科，惠伟.农药残留对食品安全的影响及对策[J].食品与发酵工业，2005，31（6）：80-84.

[2]崔洪力，李强，刘美良.农药残留及监控对策[J].农业与技术，2002，22（5）：74-76.

[3]SerraB，MoralesMD，ZhangJB，etal.In-a-dayelectrochemicaldetectionofcoliformsindrinkingwaterusingatyrosinasecompositebiosensor[J].AnalyticalChemistry，2005，77（24）：8115-8121.

[4]Tran-MinhC，PandeyPC，KumaranS.Studiesonacetylcholinesensoranditsanalyticalapplicationbasedontheinhibitionofcholinesterase[J].Biosensors&Bioelectronics，1990，5（6）：461-471.

[5]HummersJrWS，OffemanRE.Preparationofgraphiticoxide[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety，1958，80（6）：1339.

[6]DuD，ChenWJ，CaiJ，etal.DevelopmentofacetylcholinesterasebiosensorbasedonCdTequantumdotsmodifiedcysteamineself-assembledmonolayers[J].JournalofElectroanalyticalChemistry，2008，623（1）：81-85.

[7]DuD，ChenSZ，CaiJ，etal.ImmobilizationofacetylcholinesteraseonGoldnanoparticlesembeddedinsol-gelfilmforamperometricdetectionoforganophosphorousinsecticide[J].Biosensors&Bioelectronics，2007，23（1）：130-134.

[8]LeeCG，WeiXD，KysarJW，etal.Measurementoftheelasticpropertiesandintrinsicstrengthofmonolayergraphene[J].Science，2008，321（5887）：385-388.endprint