不同长春花中3种生物碱的含量测定

詹小宁

【摘 要】 目的：建立快速准确的长春花内生物碱含量测定方法，为寻找高含量品种提供方法和依据。方法：采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），对收集到的10个长春花品种中的文多灵、长春质碱、长春碱含量进行了测定，色谱柱：Dikma Diamonsil-C18 （ 46mm ×250mm， 5μm）；流动相为A∶07%二乙胺（磷酸调整pH至72）；B：乙腈：甲醇=25：40。A∶B=35∶65；流速1ml/min。柱温35℃。检测波长：280nm。结果：文多灵：Y=200×106X+546×104，r=09999，线性范围：02～4μg；长春质碱：Y=228×106X+831×104，r=09999，线性范围：02～4μg；长春碱：Y=176×106X-717×104，r=09999，线性范围：02～4μg。文多灵含量最高的是1号品种，长春质碱含量最高的是3号品种，长春碱含量最高的是2号品种，三种生物碱总和最高的是3号品种。结论：该方法简便、快速，分析准确，适合对长春花内主要生物碱做高通量的筛选。综合考虑总碱的含量和最重要的长春碱的含量，1号品种适合作为代谢调控的本体。[JP]

【关键词】 长春花；长春碱；长春质碱；文多灵；RP-HPLC

【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）24-0010-04

Determination of three kinds of important alkaloids in Catharanthus roseus from ten different habitats

ZHAN Xiao-ning

The first affiliated hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China

Abstract：Objective To establish a fast and accurate method of determination of alkaloids in Catharanthus roseus for finding high-content varieties. Method To determinate the contents of Vinblastine， Catharanthine and Vindoline in the 10 varieties of Catharanthus roseus by RP-HPLC，HPLC method is performed on Dikma Diamonsil - C18 （46mm×250mm， 5μm）column， mobile phase：A：07% diethylamine（pH 72 adjusted by phosphoric acid ）；B：acetonitrile∶methanol =25∶40.A∶B = 35∶65； flow rate is 1ml/min.Column temperature is 35 ℃. Detected at 280nm.Results Vindoline：Y=200×106X+546×104，r=09999，linear range：02 ～ 4μg；Catharanthine：Y=228×106X+831×104，r=09999，linear：02 ～ 4μg；Vinblastine：Y=176×106X-717×104，r=09999，linear range：02～ 4μg.The species of the highest content of vindoline is the 1st， Catharanthine is the 3rd， vinblastine is the 2nd species， the highest sum of three alkaloids is on the 3rd varieties.Conclusion This method is simple， reliable， repeatable， and is suitable for High-throughput screening of the Alkaloids content in Catharanthus roseus. The 1st varieties is suitable as the body of metabolic regulation.

Keywords：Catharanthus roseus； vinblastine； catharanthine； vindoline； RP-HPLC

长春花Catharanthus roseus （L. ） G. Don 为夹竹桃科（Apocynaceae） 长春花属（Catharanthus） 植物，原产于非洲东海岸，现广泛分布于世界各地，我国的广东、广西、云南、海南、贵州、四川以及江浙一带均有栽培。作为一种传统的民间药用植物，长春花常被用来治疗疟疾、腹泻、糖尿病、高血压、皮肤病及何杰金氏病等。长春花的主要活性成分生物碱（Alkaloids）是植物天然次生代谢产物中数量最多的一类含氮碱性化合物。许多生物碱由于具有特殊的药理学活性已引起人们越来越多的关注。长春花中含有的长春碱（Vinblastine）是一类重要的抗肿瘤萜类吲哚生物碱（Terpenoid indole alkaloids， TIAs） [1]，在临床上主要用于治疗何杰金氏病和绒毛上皮癌，对淋巴肉瘤、黑色素瘤、卵巢癌、白血病等也有一定疗效，是目前广泛应用的抗肿瘤植物药之一[2]。此外，文多灵和长春质碱还是合成长春碱的前体[3]。目前，长春碱、长春新碱和长春瑞宾已经用于临床[4]。长春花类生物碱的主要来源依然是从天然植物中提取，但这些生物碱在天然长春花植株中含量较低，随着市场需求的增加，从天然长春花植株中提取生物碱不能满足市场需求。利用细胞培养等方法生产长春花生物碱的研究虽然取得了一些进展，但是大规模培养的细胞生物碱产量很低[5]，而且由于培养细胞中不表达一些合成途径的关键基因，使得部分生物碱无法在培养细胞中合成[6]，因此还不具备投入生产的潜力。近年来，旨在提高长春花植株中生物碱含量的研究开展很广泛，特别是利用代谢调控的方法获得生物碱含量高的长春花品种获得了较大进展[7]，因此我们需要寻找现有品种中生物碱含量高的品种，以其为研究对象，利用代谢调控方法获得高含量的长春花品种，解决现有的资源不足的问题。

本研究利用RP-HPLC[8]方法对收集到的10种长春花品种中的文多灵、长春质碱和长春碱的含量进行分析，以期获得长春花类生物碱含量高的品种。

1 仪器与试剂

11 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色谱工作站（美国Waters公司）；DL-720B型超声水浴（上海之信仪器有限公司）；DHG-9075A型恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型电子天平（德国赛多利斯仪器公司）； PHS-3TC型pH计（上海天达仪器有限公司）；Ultrapure uvf纯水仪（上海和泰仪器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋转蒸发仪（上海鲁伊工贸有限公司）。

12 试剂 文多灵批号2182-14-1，2100-2011；长春质碱批号2468-21-5，10605-2011；长春碱批号143-67-9，9011-2010，购自上海同田生物技术股份有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯， 二乙胺、磷酸为分析纯，水为高纯水。

13 材料 本实验选用长春花购于美国泛美种子公司，包括太平洋系列品种5种，清凉系列品种2种，大力神系列品种3种。10种长春花药材均种植于上海交通大学农业与生物学院农场。采用温室大棚种植，温度保持在20℃以上。于8月采集样品，每个品种随机选取3株，收集植株的叶子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；准确称量干粉各05g，将同一品种的3份干粉混合均匀后保存于4℃冰箱备用。

2 实验方法

21 标准品的配制 精密称取三种标准样品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超声20min使之溶解后，定容至刻度，浓度为1mg/ml。经04μm微孔滤膜过滤后保存于4℃冰箱。使用时根据需要用色谱纯甲醇稀释。

22 测试样品的制备方法的选择

221 提取溶剂的选择 准确称取同一样品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分别精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超声（功率600W，频率99 kHz）提取30min，放冷，分别补加相应溶剂至刻度，摇匀，045μm微孔滤膜过滤，取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定。结果表明以甲醇作溶剂，文多灵、长春质碱、长春碱的提取率均高于其他溶剂，故本法采用甲醇作为提取溶剂。

222 提取方法的选择 冷浸法：样品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，离心后倾出上清液，重复3次，合并上清液，减压蒸干，5ml甲醇定容；超声法：1g样品，加甲醇10ml，超声半小时，离心后倾出上清液，重复3次，合并上清液，减压蒸干，5ml甲醇定容；热回流法：样品1g，加10ml甲醇，60℃热回流提取3次，合并提取液减压蒸干，5ml甲醇定容。将3种方法提取液分别过045μm微孔滤膜，进样10μl，测得热回流和超声法提取效率均高于冷浸法，考虑到试验的可操作性和安全性，故选择超声法提取。

通过进一步的优化发现用5倍量的甲醇超声2次，即能提取完全，超声前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最终选定测试样品制备方法为：精密称取样品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超声30min，12000rpm离心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，离心，合并两次的上清液，减压干燥至恒重，1ml甲醇定容；经045μm微孔滤膜过滤后保存于4℃冰箱。

23 色谱条件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色谱柱。流动相为A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸调整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱温35℃；检测波长：280nm；进样量为40μl。文多灵、长春质碱、长春碱与相邻色谱峰分离度均大于15，理论塔板数按三者的峰计算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范围内。文多灵、长春质碱和长春碱的保留时间分别为9909、13819、17206min。

24 精密度试验 取21项下标准品混合溶液，自动进样器进样40μl，重复6次，测得三种生物碱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明仪器精密度良好。

25 稳定性实验 精密吸取供试品液40μl，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定三种生物碱的峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为140%、094%、161%，表明供试品液在24h内稳定。

26 重复性实验 准确称取同一样品6份，每份02g，按照23项下色谱条件进行测定，三种生物碱的含量的相对标准偏差（RSD）分别为198%、145%、138%，表明方法重复性良好。

27 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品（样品1）3份，每份02g，分别加入上述混合标准品02，04，08ml，形成高、中、低3个浓度，依照上述方法进行样品处理和测定，计算三种生物碱的回收率，结果平均回收率分别为10284%、9886%、9773%，RSD分别为135%、209%、245%，表明方法加样回收率良好。

28 色谱峰纯度分析 采用Empower 软件系统对样品中的文多灵，长春质碱和长春碱分析峰纯度，峰纯度图中纯度线均位于自动阈值线下方（图1） ，色谱峰纯度角值小于阈值，表明吸收峰为光谱纯。通过分别和文多灵，长春质碱，长春碱的标准品的光谱曲线匹配，亦匹配良好。

29 标准曲线 将上述标准品溶液稀释至01μg/μl，用自动进样器分别进样5级标准：分别精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，上述色谱条件洗脱，测定峰面积。通过Empower软件制作以文多灵，长春质碱，长春碱进样量X（单位：μg）为横坐标，峰面积Y（单位：微伏*秒） 为纵坐标绘制标准曲线。 文多灵回归方程为Y=200×106X+546×104， r=09999，线性范围为02～40μg。长春质碱回归方程为Y=228×106X+831×104，r=09999，线性范围为02～40μg。长春碱回归方程为Y=176×106X-717×104 ，r=09999，线性范围为02～40μg。

3 实验结果

按上述方法对10份长春花样品进行测定。每批重复测定3次，结果见表1。

4 讨论

在长春花样品制备的方法中，常见的有甲醇提取法和酸液提取-碱化后有机溶剂萃取法[9]。通过比较发现，甲醇提取效率高，速度快，虽然提取物中含有较多杂质，然而通过改变洗脱条件，可以让目的成分和杂质有效分离，并不影响测定。酸液提取-碱化后有机溶剂萃取法的提取物中虽然杂质较少，但是操作复杂，步骤繁多。本研究旨在多品种间的横向比较，故尽量采用简便的操作办法，回避操作误差，因此本研究采用甲醇提取法。通过优化，采用1ml甲醇提取02g叶片干粉2次，操作可以缩小到2ml离心管内进行，便于大量操作。提取物浓度合适，通过适当增加进样量，能够保证含量较少的长春碱可以被检测到。

在色谱条件的选择中，流动相中甲醇和乙腈的比例对分离度和峰形均有较大影响，乙腈的增加有助于获得良好的峰形，但当乙腈比例大于25%时，长春质碱会和样品中的长春碱形成交叉，加入甲醇有助于两者的分离。同时，在流动相中选择二乙胺-磷酸溶液为缓冲体系，并通过调节溶液A与溶液B的比例使3种物质得到较好的分离。在实验中，当A 的比例大于35%时，最后出峰的长春碱保留时间延长，当A的比例小于35%时，长春碱保留时间前移和样品中极性大的杂质混出，难以得到满意的分离度。因此，A∶B的比例在35∶65 时较为适宜。流动相的pH值对分离效果也有很大的影响，实验以缓冲溶液调整流动相的pH值。将缓冲溶液的pH值分别设为50、60、70、72、74、76、和78，观察pH值对峰形及分离效果的影响。结果表明：当缓冲溶液pH值为72时，各峰间分离度增大，峰形较好，出峰时间适宜。因此，选择缓冲溶液pH值为72。

本研究利用RP-HPLC[8]方法对收集到的10种长春花品种中的文多灵、长春质碱和长春碱的含量进行分析，以期获得长春花类生物碱含量高的品种。

1 仪器与试剂

11 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色谱工作站（美国Waters公司）；DL-720B型超声水浴（上海之信仪器有限公司）；DHG-9075A型恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型电子天平（德国赛多利斯仪器公司）； PHS-3TC型pH计（上海天达仪器有限公司）；Ultrapure uvf纯水仪（上海和泰仪器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋转蒸发仪（上海鲁伊工贸有限公司）。

12 试剂 文多灵批号2182-14-1，2100-2011；长春质碱批号2468-21-5，10605-2011；长春碱批号143-67-9，9011-2010，购自上海同田生物技术股份有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯， 二乙胺、磷酸为分析纯，水为高纯水。

13 材料 本实验选用长春花购于美国泛美种子公司，包括太平洋系列品种5种，清凉系列品种2种，大力神系列品种3种。10种长春花药材均种植于上海交通大学农业与生物学院农场。采用温室大棚种植，温度保持在20℃以上。于8月采集样品，每个品种随机选取3株，收集植株的叶子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；准确称量干粉各05g，将同一品种的3份干粉混合均匀后保存于4℃冰箱备用。

2 实验方法

21 标准品的配制 精密称取三种标准样品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超声20min使之溶解后，定容至刻度，浓度为1mg/ml。经04μm微孔滤膜过滤后保存于4℃冰箱。使用时根据需要用色谱纯甲醇稀释。

22 测试样品的制备方法的选择

221 提取溶剂的选择 准确称取同一样品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分别精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超声（功率600W，频率99 kHz）提取30min，放冷，分别补加相应溶剂至刻度，摇匀，045μm微孔滤膜过滤，取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定。结果表明以甲醇作溶剂，文多灵、长春质碱、长春碱的提取率均高于其他溶剂，故本法采用甲醇作为提取溶剂。

222 提取方法的选择 冷浸法：样品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，离心后倾出上清液，重复3次，合并上清液，减压蒸干，5ml甲醇定容；超声法：1g样品，加甲醇10ml，超声半小时，离心后倾出上清液，重复3次，合并上清液，减压蒸干，5ml甲醇定容；热回流法：样品1g，加10ml甲醇，60℃热回流提取3次，合并提取液减压蒸干，5ml甲醇定容。将3种方法提取液分别过045μm微孔滤膜，进样10μl，测得热回流和超声法提取效率均高于冷浸法，考虑到试验的可操作性和安全性，故选择超声法提取。

通过进一步的优化发现用5倍量的甲醇超声2次，即能提取完全，超声前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最终选定测试样品制备方法为：精密称取样品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超声30min，12000rpm离心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，离心，合并两次的上清液，减压干燥至恒重，1ml甲醇定容；经045μm微孔滤膜过滤后保存于4℃冰箱。

23 色谱条件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色谱柱。流动相为A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸调整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱温35℃；检测波长：280nm；进样量为40μl。文多灵、长春质碱、长春碱与相邻色谱峰分离度均大于15，理论塔板数按三者的峰计算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范围内。文多灵、长春质碱和长春碱的保留时间分别为9909、13819、17206min。

24 精密度试验 取21项下标准品混合溶液，自动进样器进样40μl，重复6次，测得三种生物碱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明仪器精密度良好。

25 稳定性实验 精密吸取供试品液40μl，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定三种生物碱的峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为140%、094%、161%，表明供试品液在24h内稳定。

26 重复性实验 准确称取同一样品6份，每份02g，按照23项下色谱条件进行测定，三种生物碱的含量的相对标准偏差（RSD）分别为198%、145%、138%，表明方法重复性良好。

27 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品（样品1）3份，每份02g，分别加入上述混合标准品02，04，08ml，形成高、中、低3个浓度，依照上述方法进行样品处理和测定，计算三种生物碱的回收率，结果平均回收率分别为10284%、9886%、9773%，RSD分别为135%、209%、245%，表明方法加样回收率良好。

28 色谱峰纯度分析 采用Empower 软件系统对样品中的文多灵，长春质碱和长春碱分析峰纯度，峰纯度图中纯度线均位于自动阈值线下方（图1） ，色谱峰纯度角值小于阈值，表明吸收峰为光谱纯。通过分别和文多灵，长春质碱，长春碱的标准品的光谱曲线匹配，亦匹配良好。

29 标准曲线 将上述标准品溶液稀释至01μg/μl，用自动进样器分别进样5级标准：分别精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，上述色谱条件洗脱，测定峰面积。通过Empower软件制作以文多灵，长春质碱，长春碱进样量X（单位：μg）为横坐标，峰面积Y（单位：微伏*秒） 为纵坐标绘制标准曲线。 文多灵回归方程为Y=200×106X+546×104， r=09999，线性范围为02～40μg。长春质碱回归方程为Y=228×106X+831×104，r=09999，线性范围为02～40μg。长春碱回归方程为Y=176×106X-717×104 ，r=09999，线性范围为02～40μg。

3 实验结果

按上述方法对10份长春花样品进行测定。每批重复测定3次，结果见表1。

4 讨论

在长春花样品制备的方法中，常见的有甲醇提取法和酸液提取-碱化后有机溶剂萃取法[9]。通过比较发现，甲醇提取效率高，速度快，虽然提取物中含有较多杂质，然而通过改变洗脱条件，可以让目的成分和杂质有效分离，并不影响测定。酸液提取-碱化后有机溶剂萃取法的提取物中虽然杂质较少，但是操作复杂，步骤繁多。本研究旨在多品种间的横向比较，故尽量采用简便的操作办法，回避操作误差，因此本研究采用甲醇提取法。通过优化，采用1ml甲醇提取02g叶片干粉2次，操作可以缩小到2ml离心管内进行，便于大量操作。提取物浓度合适，通过适当增加进样量，能够保证含量较少的长春碱可以被检测到。

在色谱条件的选择中，流动相中甲醇和乙腈的比例对分离度和峰形均有较大影响，乙腈的增加有助于获得良好的峰形，但当乙腈比例大于25%时，长春质碱会和样品中的长春碱形成交叉，加入甲醇有助于两者的分离。同时，在流动相中选择二乙胺-磷酸溶液为缓冲体系，并通过调节溶液A与溶液B的比例使3种物质得到较好的分离。在实验中，当A 的比例大于35%时，最后出峰的长春碱保留时间延长，当A的比例小于35%时，长春碱保留时间前移和样品中极性大的杂质混出，难以得到满意的分离度。因此，A∶B的比例在35∶65 时较为适宜。流动相的pH值对分离效果也有很大的影响，实验以缓冲溶液调整流动相的pH值。将缓冲溶液的pH值分别设为50、60、70、72、74、76、和78，观察pH值对峰形及分离效果的影响。结果表明：当缓冲溶液pH值为72时，各峰间分离度增大，峰形较好，出峰时间适宜。因此，选择缓冲溶液pH值为72。

本研究利用RP-HPLC[8]方法对收集到的10种长春花品种中的文多灵、长春质碱和长春碱的含量进行分析，以期获得长春花类生物碱含量高的品种。

1 仪器与试剂

11 仪器 Waters高效液相色谱仪，包括Waters Alliance 2695 Separation Module、2996 Photodiode Array Detector、Empower Pro 色谱工作站（美国Waters公司）；DL-720B型超声水浴（上海之信仪器有限公司）；DHG-9075A型恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Sarrorius BS210S 型电子天平（德国赛多利斯仪器公司）； PHS-3TC型pH计（上海天达仪器有限公司）；Ultrapure uvf纯水仪（上海和泰仪器有限公司）；Zx-98-1 2lc型旋转蒸发仪（上海鲁伊工贸有限公司）。

12 试剂 文多灵批号2182-14-1，2100-2011；长春质碱批号2468-21-5，10605-2011；长春碱批号143-67-9，9011-2010，购自上海同田生物技术股份有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯， 二乙胺、磷酸为分析纯，水为高纯水。

13 材料 本实验选用长春花购于美国泛美种子公司，包括太平洋系列品种5种，清凉系列品种2种，大力神系列品种3种。10种长春花药材均种植于上海交通大学农业与生物学院农场。采用温室大棚种植，温度保持在20℃以上。于8月采集样品，每个品种随机选取3株，收集植株的叶子，于50℃烘干至恒重，磨成干粉；准确称量干粉各05g，将同一品种的3份干粉混合均匀后保存于4℃冰箱备用。

2 实验方法

21 标准品的配制 精密称取三种标准样品各10mg，于10ml容量瓶中用甲醇溶解，超声20min使之溶解后，定容至刻度，浓度为1mg/ml。经04μm微孔滤膜过滤后保存于4℃冰箱。使用时根据需要用色谱纯甲醇稀释。

22 测试样品的制备方法的选择

221 提取溶剂的选择 准确称取同一样品3份，每份200mg，置5ml容量瓶中，分别精密加入氯仿、甲醇、05%乙酸水溶液50ml，超声（功率600W，频率99 kHz）提取30min，放冷，分别补加相应溶剂至刻度，摇匀，045μm微孔滤膜过滤，取续滤液10μl，注入液相色谱仪，测定。结果表明以甲醇作溶剂，文多灵、长春质碱、长春碱的提取率均高于其他溶剂，故本法采用甲醇作为提取溶剂。

222 提取方法的选择 冷浸法：样品1g，加20ml甲醇，浸泡24h，离心后倾出上清液，重复3次，合并上清液，减压蒸干，5ml甲醇定容；超声法：1g样品，加甲醇10ml，超声半小时，离心后倾出上清液，重复3次，合并上清液，减压蒸干，5ml甲醇定容；热回流法：样品1g，加10ml甲醇，60℃热回流提取3次，合并提取液减压蒸干，5ml甲醇定容。将3种方法提取液分别过045μm微孔滤膜，进样10μl，测得热回流和超声法提取效率均高于冷浸法，考虑到试验的可操作性和安全性，故选择超声法提取。

通过进一步的优化发现用5倍量的甲醇超声2次，即能提取完全，超声前浸泡1h有利于提高提取效率。因此最终选定测试样品制备方法为：精密称取样品干粉02g，加入甲醇1ml，浸泡1h后超声30min，12000rpm离心，取出上清液；再加入1ml甲醇提取一次，离心，合并两次的上清液，减压干燥至恒重，1ml甲醇定容；经045μm微孔滤膜过滤后保存于4℃冰箱。

23 色谱条件 Dikma Diamonsil-C18 （46mm×250mm， 5μm）色谱柱。流动相为A：[KG-*2]07%二乙胺（磷酸调整pH至72）；B：乙腈∶[KG-*2]甲醇=25∶[KG-*2]40。A∶[KG-*2]B=35∶[KG-*2]65；流速1ml/min。柱温35℃；检测波长：280nm；进样量为40μl。文多灵、长春质碱、长春碱与相邻色谱峰分离度均大于15，理论塔板数按三者的峰计算均不低于5000，拖尾因子均在095～105范围内。文多灵、长春质碱和长春碱的保留时间分别为9909、13819、17206min。

24 精密度试验 取21项下标准品混合溶液，自动进样器进样40μl，重复6次，测得三种生物碱峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为056%、096%、044%，均小于1%（n=6） ，表明仪器精密度良好。

25 稳定性实验 精密吸取供试品液40μl，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定三种生物碱的峰面积的相对标准偏差（RSD）分别为140%、094%、161%，表明供试品液在24h内稳定。

26 重复性实验 准确称取同一样品6份，每份02g，按照23项下色谱条件进行测定，三种生物碱的含量的相对标准偏差（RSD）分别为198%、145%、138%，表明方法重复性良好。

27 加样回收率实验 精密称取已知含量的样品（样品1）3份，每份02g，分别加入上述混合标准品02，04，08ml，形成高、中、低3个浓度，依照上述方法进行样品处理和测定，计算三种生物碱的回收率，结果平均回收率分别为10284%、9886%、9773%，RSD分别为135%、209%、245%，表明方法加样回收率良好。

28 色谱峰纯度分析 采用Empower 软件系统对样品中的文多灵，长春质碱和长春碱分析峰纯度，峰纯度图中纯度线均位于自动阈值线下方（图1） ，色谱峰纯度角值小于阈值，表明吸收峰为光谱纯。通过分别和文多灵，长春质碱，长春碱的标准品的光谱曲线匹配，亦匹配良好。

29 标准曲线 将上述标准品溶液稀释至01μg/μl，用自动进样器分别进样5级标准：分别精密吸取6μl，8μl，10μl，20μl，40μl，置于1ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，上述色谱条件洗脱，测定峰面积。通过Empower软件制作以文多灵，长春质碱，长春碱进样量X（单位：μg）为横坐标，峰面积Y（单位：微伏*秒） 为纵坐标绘制标准曲线。 文多灵回归方程为Y=200×106X+546×104， r=09999，线性范围为02～40μg。长春质碱回归方程为Y=228×106X+831×104，r=09999，线性范围为02～40μg。长春碱回归方程为Y=176×106X-717×104 ，r=09999，线性范围为02～40μg。

3 实验结果

按上述方法对10份长春花样品进行测定。每批重复测定3次，结果见表1。

4 讨论

在长春花样品制备的方法中，常见的有甲醇提取法和酸液提取-碱化后有机溶剂萃取法[9]。通过比较发现，甲醇提取效率高，速度快，虽然提取物中含有较多杂质，然而通过改变洗脱条件，可以让目的成分和杂质有效分离，并不影响测定。酸液提取-碱化后有机溶剂萃取法的提取物中虽然杂质较少，但是操作复杂，步骤繁多。本研究旨在多品种间的横向比较，故尽量采用简便的操作办法，回避操作误差，因此本研究采用甲醇提取法。通过优化，采用1ml甲醇提取02g叶片干粉2次，操作可以缩小到2ml离心管内进行，便于大量操作。提取物浓度合适，通过适当增加进样量，能够保证含量较少的长春碱可以被检测到。

在色谱条件的选择中，流动相中甲醇和乙腈的比例对分离度和峰形均有较大影响，乙腈的增加有助于获得良好的峰形，但当乙腈比例大于25%时，长春质碱会和样品中的长春碱形成交叉，加入甲醇有助于两者的分离。同时，在流动相中选择二乙胺-磷酸溶液为缓冲体系，并通过调节溶液A与溶液B的比例使3种物质得到较好的分离。在实验中，当A 的比例大于35%时，最后出峰的长春碱保留时间延长，当A的比例小于35%时，长春碱保留时间前移和样品中极性大的杂质混出，难以得到满意的分离度。因此，A∶B的比例在35∶65 时较为适宜。流动相的pH值对分离效果也有很大的影响，实验以缓冲溶液调整流动相的pH值。将缓冲溶液的pH值分别设为50、60、70、72、74、76、和78，观察pH值对峰形及分离效果的影响。结果表明：当缓冲溶液pH值为72时，各峰间分离度增大，峰形较好，出峰时间适宜。因此，选择缓冲溶液pH值为72。