苦豆子总碱温敏凝胶的制备及体外评价

魏玉辉， 张建萍， 段好刚， 武新安

(兰州大学第一医院药剂科，甘肃 兰州730000)

妇科炎症是女性的常见疾病，主要是指女性生殖器官的炎症，包括外阴炎、阴道炎、宫颈炎、盆腔炎等，这些炎症可引起严重的生殖器并发症(包括子宫颈炎和子宫内膜炎)，也可使患者增加感染HIV 病毒和早产的风险［1-2］。目前，临床上主要是通过黏膜局部给药来治疗这些病症，使用的剂型主要有栓剂、膏剂以及泡腾片，但均存在药物分散不均匀，导致吸收不完全、阴道内存在异物感、给药时易损伤腔道黏膜以及污染衣物等缺点。

温敏凝胶是一种环境敏感型智能凝胶，在室温下为溶液状态，而在体温环境下能发生相转变，形成非化学交联型半固体凝胶［3］。该剂型在体外呈溶液状，易于给药，当到达阴道腔内后则迅速形成凝胶且不易流出腔道，对衣物污染较轻，使用方便，可增加患者顺应性。另外，凝胶剂可使药物在腔道内分散均匀，药物与黏膜的接触面积增加，可提高生物利用度，达到增强疗效的目的。

苦豆子总碱系豆科槐属植物苦豆子 Sophora alopearoids L.中的生物碱，主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱和氧化槐定碱等［4］。目前，用苦豆子总碱注射液肌注治疗宫颈糜烂、宫颈炎、附件炎等妇科疾病，以及使用其栓剂治疗前列腺炎等［5-7］，疗效确切，副作用较小，但长期使用时，患者疼痛感较强烈，顺应性较差。目前，尚未有使用苦豆子总碱温敏凝胶剂治疗各种妇科炎症的相关报道，故研制开发这种剂型具有良好的应用价值和市场前景。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器 HPLC 系统，包括LC-20A 二元梯度泵、SPD-20MA 二极管阵列检测器、SiL-20A 自动进样系统、DGU-20A 再线脱气系统，数据采用LC solution 色谱工作站分析(日本岛津);RC-3B 药物溶出仪(天津大学无线电厂);JHS-1 电子恒速搅拌器(杭州仪表电机有限公司);数字显示温度计(深圳市万博鑫科技有限公司);RYJ-6B药物透皮扩散试验仪 (上海黄海药检仪器有限公司);PHS-2C 数字式酸度计(金坛市荣华仪器制造有限公司)。

1.2 药品、试剂与材料 苦豆子总生物碱(宁夏紫荆花药业股份有限公司，批号040228);槐定碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号0784-9702);泊洛沙姆407 (相对分子量12 600，pH 为6 ～7.4，批号WPYF562C)、泊洛沙姆188 (相对分子量8 400，pH 为6 ～7，批号WPEE587E)固体分散体(德国BASF 公司)。甲醇为色谱纯(美国迪马科技公司);去离子水(自制)。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，雄性，体质量18 ～22 g (兰州大学实验动物中心，合格证号SCYK ［甘］2009-0004)。

2 实验方法与结果

2.1 苦豆子总碱中槐定碱含有量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 VP-ODS 分析柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为甲醇-磷酸二氢钠(0.05 mol/L)-三乙胺(20 ∶80 ∶0.1)，0.45 μm 微孔滤膜过滤并脱气;体积流量1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长210 nm;进样量20 μL。

2.1.2 线性范围 精密称取槐定碱标准品6 mg，置于10 mL量瓶中，用水溶解并定容，得到质量浓度为580 μg/mL的贮备液，4 ℃下贮藏备用。然后，精密吸取上述贮备液适量，用水稀释至质量浓度分别为9.06、18.13、36.25、72.5、145、290、580 μg/mL 的 标 准 液，在“2.1.1”项色谱条件下测定，用峰面积(Y)对质量浓度(X)进行回归，得到标准曲线方程Y =19 449X +9 809.2，R2=0.999 9。

2.1.3 精密度与准确度 配制高、中、低(464.0、72.5和18.13 μg/mL)3 种质量浓度的槐定碱标准液，于同一天不同时间内重复测定5 次，计算日内精密度;于不同天内每日测定1 次，连续测定5 d，计算日间精密度。结果表明，三者的日内和日间精密度均小于5%，其准确度在100% ～104%之间。

2.2 胶凝温度(gelation temperature，GT)的测定 参照文献［8］，西林瓶中盛有待测溶液和磁力搅拌子，插入温度计，再将西林瓶放入冰水浴中，开启电磁搅拌，使水浴持续缓慢升温。当磁力搅拌子完全停止转动时，所对应的温度即为胶凝温度，平行测定3 次，取平均值。

2.3 处方和制备工艺

2.3.1 处方 单因素试验显示，当P407、P188、1，2-丙二醇和稀盐酸的浓度分别为22.5%、3.1%、10.0%和2.5%时，其胶凝温度为(33.1 ±0.2)℃，pH 值为7.06，其最佳制备处方见表1。

表1 苦豆子总碱凝胶的处方

2.3.2 制备工艺 将处方量的苦豆子总碱、1，2-丙二醇、0.02%苯扎溴铵和稀盐酸溶于适量纯化水中，搅拌加入泊洛沙姆407 和188，4 ℃下贮存24 h 至完全溶解，最后加水至全量，搅拌混匀，即得。

2.4 体外释放度 采用透析袋法［9］，精密量取2%苦豆子温敏凝胶和2%苦豆子水溶液各5.0 mL (相当于总碱约100 mg)，置于加热预处理好的透析袋中，扎紧两端，固定于桨上。用pH 为7.4 的PBS 缓冲液400 mL 进行释放度测定，转速100 r/min，温度(37.0 ±0.1)℃，于第0.5、1、2、3、4、5、6、8、11、24 小时取样5 mL，同时补加等量恒温的磷酸盐缓冲液。样品经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，取续滤液20 μL，进样分析，HPLC 法测定槐定碱的浓度，计算其累计释放量和释放百分数。

然后，以累积释放百分数对时间作图，得槐定碱的累积释放曲线，见图1。由图可知，苦豆子总碱温敏凝胶可延缓槐定碱的释放。在2 h 时，凝胶组和水溶液组的释放百分数分别为48.29%和85.50%，而在24 h 时则分别为96.33%和99.11%。

图1 苦豆子总碱凝胶中槐定碱体外累积释放曲线(n=3)

2.5 离体皮肤渗透试验 采用Franz 扩散池法在(32 ±2)℃下进行透皮试验。将小鼠皮肤固定在供给室和接收室之间，皮肤表皮层面向供给室，扩散池的有效渗透面积为2.8 cm2，接收液为水溶液，接收室体积为6.5 mL。然后，分别取2%苦豆子总碱水溶液、含2%苦豆子总碱的10.0%丙二醇水溶液、含2%苦豆子总碱的温敏凝胶各0.5 mL，涂抹于供给室中的皮肤表面，将接收池置于恒温水浴中，开启电磁搅拌器以300 r/min 的速度搅拌，于第0、0.5、1、2、3、5、7、10、13 和24 h 取出接收液0.2 mL，并及时补充等量恒温的接收液。接着，将取得的样品置于离心管中离心5 min (10 000 r/min)，取20 μL 进样测定，计算槐定碱浓度、累积渗透量和透皮速率。24 h 后，取下皮肤，用水洗净，并用甲醇棉球擦干皮肤表面，剪碎，用适量甲醇浸润，超声提取15 min，置离心管中离心5 min (10 000 r/min)，取20 μL 进样测定槐定碱浓度，并计算药物的皮肤滞留量。

以槐定碱的累积释放量对时间作图，见图2。由图可知，凝胶组和10.0%1，2-丙二醇组的透皮能力均强于水溶液组。在前7 h，1，2-丙二醇对槐定碱的促渗作用几乎与凝胶组一致;在13 h 后，10.0%1，2-丙二醇组的促透作用有所下降，但凝胶组的促渗作用仍然较明显，其累积渗透量显著高于前者，表明凝胶组与水溶液及10.0%1，2-丙二醇组相比，具有明显的缓释作用。

图2 苦豆子总碱凝胶中槐定碱在离体皮肤累积渗透曲线(n=3)

另外，槐定碱的稳态透皮速率、24 h 时的累积渗透量和皮肤滞留量见表2。由表可知，与水溶液组相比，24 h时10.0%1，2-丙二醇组的稳态透皮速率和累积渗透量均显著增加(P ＜0.05)，而在24 h 时凝胶组的稳态透皮速率和累积渗透量分别增加了18.13 倍和17.98 倍(P ＜0.01);与10.0%1，2-丙二醇组相比，24 h 时凝胶组的稳态透皮速率和累积渗透量均显著增加(P ＜0.05)，而各组别中槐定碱在皮肤内的滞留量差异均无统计学意义(P ＞0.05)，表明10.0%1，2-丙二醇能显著促进槐定碱的经皮渗透，并且凝胶组的促渗作用优于10.0%1，2-丙二醇溶液。

表2 苦豆子总碱中槐定碱的经皮渗透特性(n=3)

3 讨论

3.1 基质的选择 泊洛沙姆407 (P407)是一种高分子非离子表面活性剂，其毒性低，生物相容性好，是理想的药物控释载体。在测定胶凝温度过程中，发现胶凝时间较长，而泊洛沙姆188 (P188)可提高凝胶的胶凝温度，能通过氢键和离子间的作用来增强它与其他成分的结合，从而加快胶凝速度［10］。因此，本试验采用P407 和P188 作为混合基质，用于制备温敏凝胶。

3.2 生物黏附性材料的选择 常用的生物黏附性材料有卡波姆、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素和壳聚糖等，可用于改善凝胶的强度、黏附力、释放速率及流变学性质。经预实验考查，将处方量中的苦豆子总碱、1，2-丙二醇、0.02%苯扎溴铵和稀盐酸先溶于适量纯化水中，再加入卡波姆、羟丙基纤维素和羟丙甲基纤维素，结果发现卡波姆不溶胀，而两种纤维素均不溶解，原因可能是溶液体系的变化导致三者不能溶胀和溶解。另外，甲基纤维素在冷水中难以溶解，需在80 ～90℃水溶液中才能溶解，而壳聚糖虽在稀盐酸水溶液中溶解，但加入苦豆子总碱后，溶液pH 值增大，导致壳聚糖析出。因此，本试验未选用其它高分子生物黏附性材料。

3.3 体外释放试验 试验发现，苦豆子总碱温敏凝胶可延缓槐定碱的释放，这可能是泊洛沙姆在达到胶凝温度后，聚合物链上的疏水性聚氧丙稀(PPO)嵌段脱水，其分子在溶液中聚集成以脱水PPO 链为内核、以水化膨胀的聚氧乙烯(PEO)链为外壳的球状胶束［11］，从而延缓了槐定碱的释放。

3.4 体外经皮渗透试验 试验结果表明，10.0%1，2-丙二醇组和总碱凝胶组的渗透能力强于总碱水溶液，可能与1，2-丙二醇具有促进药物吸收的作用有关［12］。由于7 h 后丙二醇与凝胶组对槐定碱的促渗作用几乎一致，而13 h 后凝胶组仍能继续促进药物渗透，其累积渗透量明显高于丙二醇组。因此，凝胶组具有缓释作用。

综上所述，本试验所研制的苦豆子总碱温敏凝胶在室温下以自由流动的液体状态保存，在温度达到33℃时形成凝胶，便于给药。同时，其体外释放呈现缓释作用，而且透皮吸收效果良好。

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