短葶山麦冬多糖对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

刘用国， 许娇红， 张红雷

(福建省药品检验所，福建 福州350001)

短葶山麦冬为百合科植物山麦冬属短葶山麦冬Liriope muscari (Decne.)Baily 的干燥块根，主产于福建泉州等地，多为栽培品［1］，味甘、微苦，具有养阴生津、润肺清心的功效。

短葶山麦冬中含有甾体皂苷类、多糖类等成分，研究表明，其水提物及皂苷类成分具有免疫调节、呼吸系统调节的功能，可降低血糖、抗肿瘤、抗炎、抗心律失常等功效［2-5］。目前对其多糖的研究报道主要集中于提取分离及多糖的定量测定，对于发挥免疫调节功能机制的研究较少。实验室前期研究表明，LMP 对正常小鼠及环磷酰胺免疫抑制小鼠均有一定的免疫调节功能［6］。巨噬细胞通过对异物的吞噬、加工，向机体免疫系统呈递抗原以及促进自身释放免疫因子，是其发挥免疫调节的基础。因此LMP 的免疫调节作用可能与巨噬细胞活性相关。本实验研究LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬、加工及促进活性免疫因子分泌的影响，进一步阐明其免疫调节的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验样品 短葶山麦冬Liriope muscari (Decne.)Baily的干燥块根，采用水提醇沉法提取短葶山麦冬粗多糖，Sephadex G-100 凝胶柱对粗多糖进行纯化、精制［7］，DNS法测定纯度为83%。精密称取LMP 50 mg，紫外照射30 min 灭菌，加入RPMI-1640 培养液5 mL，溶解后用0.22 μm 滤过，即得10 mg/mL 贮备液。

1.2 实验动物 BALB/c 小鼠，SPF 级，雄性，体质量为20 ～23 g，上海市松江区松联实验动物场，实验动物生产许可证SCXK (沪)2012-0011。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器 MettlerAE200 电子天平、Heraeus 低温高速离心机、Biorad550 酶标仪、Thermo 二氧化碳培养箱、Invitrogen 细胞计数仪、ESCO A2 生物安全柜、Leica 倒置显微镜、Leica DM2000 生物显微镜、Leica DFC295 成像系统。

1.3.2 试剂 MTT、脂多糖(LPS)、硫基乙酸盐肉汤，购自Sigma 公司;PBS 缓冲液(pH 7.2 ～7.4)、RPMI-1640 细胞培养液，购自杭州吉诺医药生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);中性红细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、牛血清白蛋白(BSA)，购自碧云天公司;TNF-α(批号20131201)、IL-6 (批号20131210)检测试剂盒，购自BOSTER 公司;Transwell 小室(6.5 mm 直径，孔径8.0 μm，聚碳酸酯滤膜)购自Corning 公司。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养 小鼠腹腔注射含5%硫基乙酸盐肉汤的氯化钠注射用水1 mL，4 d 后颈椎脱臼处死，浸入95%乙醇30 s，将4 ℃预冷的RPMI-1640 细胞培养液注入小鼠腹腔，轻揉腹部1 ～2 min，回抽腹腔液体，4 ℃80 ×g 离心10 min，弃上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 细胞培养液重悬后，将细胞悬液接种于细胞培养平皿上，37 ℃、5% CO2培养箱培育3 h 后，轻轻吸弃上清，再用37 ℃预热PBS 洗涤3 次，洗去未贴壁细胞，得纯化的小鼠腹腔巨噬细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 细胞培养液重悬后，调整细胞密度为1 ×106个/mL备用［8］。

1.4.2 给药设计与分组 实验设LMP 组、LPS 模型组和空白对照组，每组设3 个复孔。LMP 贮备液用RPMI-1640 细胞培养液稀释成0.625、1.25、2.5、5 mg/mL 的溶液，实验时按1 份LMP ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 细胞培养液加入培养体系中，使LMP 终质量浓度分别为62.5、125、250、500 μg/mL。精密称取LPS 适量，用RPMI-1640细胞培养液超声溶解，配制成100 μg/mL 的溶液，实验时按1 份LPS ∶9 份含10%胎牛血清的RPMI-1640 细胞培养液加入培养体系中，使LPS 终质量浓度为10 μg/mL。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的检测 分组给药按“1.4.2”项的方法，调整细胞密度为5 ×105个/mL，每孔200 μL 加入到96 孔板中，37 ℃、5% CO2条件下培养48 h，吸去培养液，用PBS 洗涤2 次，重新加入200 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 细胞培养液，并加入20 μL 中性红染液，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，去除含有中性红染色液的培养液，用PBS 溶液洗涤2 次，每孔加入200 μL 中性红检测液，摇床上振荡10 min，酶标仪于540 nm 处测定吸光度值［9］。

1.4.4 小鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的检测 腹腔巨噬细胞收集后，用含1% BSA 的RPMI-1640 细胞培养液重悬细胞，调整细胞密度为1 ×106个/mL，趋化小室上室加入100 μL细胞悬液，下室加入600 μL 不同质量浓度的LMP 溶液，小心振荡使细胞分布均匀，置37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h 后，取出小室，弃去小室内细胞悬液，用擦镜纸擦去小室内未迁移细胞，用PBS 洗涤两次后用3%戊二醛室温固定30 min。37 ℃预热的PBS 洗净戊二醛后凉干，然后用0.25%结晶紫-甲醇染色15 min。37 ℃预热的PBS 清洗小室3 次，除去多余染料，切下小室内聚碳酸酯膜干燥后，显微镜下计数迁移到小室下表面的巨噬细胞数。每个小室随机观察10 个视野。实验重复3 次［10］。趋化结果以趋化指数(CI)表示。CI% = 给药组10 个视野下的巨噬细胞数/对照组10 个视野下的巨噬细胞数×100%。

1.4.5 小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6 的检测 分组给药按“1.4.2”项的方法，调整细胞密度为5×105个/mL，每孔200 μL 加入到96 孔板中，细胞培养48 h 后，收集上清液，采用酶联免疫法(ELISA)测定，按试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm 处测定吸光度值［10］。

1.5 实验数据统计方法 实验数据以SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析。经方差齐性检验，方差齐的实验数据采用LSD 法进行统计，方差不齐的实验数据采用Tambane 法进行统计分析。

2 实验结果

2.1 LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 由图1 可知，LPS 10 μg/mL 的质量浓度可以极大地促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用，与对照组相比，有显著差异 (P ＜0.01);LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用，在62.5 ～500 μg/mL 的质量浓度范围内，LMP 对中性红的吞噬能力不断增加，质量浓度为250 μg/mL 时与对照组比较，有显著差异(P ＜0.05);当质量浓度为500 μg/mL 时与对照组比较，有显著差异(P ＜0.01)。说明LMP 可提高腹腔巨噬细胞吞噬能力，且有一定的剂量相关性。

图1 LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响(n=3)

2.2 LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响 与对照组相比，LMP 125、250、500 μg/mL 3 组均可显著提高腹腔巨噬细胞的趋化指数CI (P ＜0.01)，对腹腔巨噬细胞趋化能力提高百分率分别为27.8%、31.0%、74.0%。说明LMP 可以增强腹腔巨噬细胞的趋化功能，且对多糖的质量浓度有一定依赖性，结果见图2。

图2 LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响(n=4)

2.3 LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6 的影响结果见图3，LPS 可明显促进小鼠腹腔巨噬细胞释放TNFα、IL-6，与对照组相比，均有显著性差异(P ＜0.01)。当不同质量浓度LMP 与小鼠腹腔巨噬细胞相作用时，62.5、125 μg/mL 两个质量浓度LMP 对TNF-α 和IL-6 释放量与对照组相比，无明显变化(P ＞0.05);当LMP 质量浓度为250 μg/mL 时，测得TNF-α 的量为(130.0 ±22.4)pg/mL，与对照组相比释放量虽有所提高，但也无显著差异(P ＞0.05);测得IL-6 分泌量为(282.5 ±33.4)pg/mL，与对照组相比，有显著性差异(P ＜0.01);当LMP 质量浓度为500 μg/mL 时，TNF-α 和IL-6 分泌量均可促进，分别达(185.5 ±15.3)pg/mL 和(352.5 ±28.1)pg/mL。

图3 LMP 对小鼠腹腔巨噬细胞释放TNF-α、IL-6 的影响(n=3)

3 讨论

巨噬细胞通过吞噬外来抗原或半抗原，进而分泌各种活性免疫因子，调节免疫系统来保护机体。病原菌和免疫因子等可诱导体内静息的巨噬细胞活化，并分化成熟为活化的巨噬细胞M1 (classically activated macrophage)和M2(alternatively activated macrophage)［11-12］，M1 细胞分泌IL-1、IL-6、NO、TNF-α 等炎症介质，刺激Th1 依赖性免疫反应，M2 细胞可分泌抗炎症因子如IL-10、TGF-β，促进Th2免疫应答。

小鼠腹腔巨噬细胞分离纯化的试验中，发现未活化的腹腔巨噬细胞，即未注射5%硫基乙酸盐肉汤的小鼠，不仅腹腔巨噬细胞获得少，每只约1 ×106个/mL，且对LPS和LMP 刺激时吞噬能力、趋化作用和分泌TNF-α、IL-6 不太敏感。

本实验结果显示250、500 μg/mL LMP 可不同程度的提高腹腔巨噬细胞吞噬能力、趋化作用和分泌TNF-α、IL-6 的作用。因此初步认为LMP 通过提高巨噬细胞活化能力，刺激Th1 依赖性免疫反应，产生炎症因子来调节机体的免疫。但LMP 通过何种途径与巨噬细胞表面受体结合，从而激活巨噬细胞，还需要进一步实验观察来说明。

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