HPLC 法同时测定二丁颗粒中的单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸

占 远， 黎田儿， 黄文平， 简 辉， 李 艳， 何明珍， 杨世林，* ， 张武岗* ，冯育林， 王永林

(1. 贵州医科大学药学院，贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳550004;2. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006;3. 江西中医药大学，江西 南昌330004)

二丁颗粒是《中国药典》2010 年版收载的常用中成药，具有清热解毒的功效，用于治疗火热毒盛所致的热疖痈毒、咽喉肿痛、风热火眼，临床可用于治疗急性咽炎、急性支气管炎等［1-4］，该药物主要由紫花地丁、蒲公英、板蓝根和半边莲组成。其中，蒲公英的主要成分单咖啡酰基酒石酸和菊苣酸具有增强人体免疫、抗炎、抗氧化作用［5-7］，目前《中国药典》2010 年版仅以秦皮乙素这一种成分来衡量二丁颗粒的质量，具有一定局限性。因此，基于单咖啡酰基酒石酸和菊苣酸的药理活性，本实验采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定二丁颗粒中单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸这3 种成分的含有量，以期为该药物的进一步研究奠定基础，同时为其质量控制提供科学依据，用于保证临床安全用药。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20ADXR HPLC 色谱仪，包括可变波长紫外检测器(PDA)、岛津工作站(日本岛津公司);Millipore Simplicity 超纯水器 (美国Millipore 公司);AUW220D 电子分析天平(上海天平仪器厂);AB135-S 电子天平(十万分之一，瑞士Mettler Toledo 公司)。

1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck 公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

1.3 对照品 单咖啡酰基酒石酸对照品(批号D75-20141017，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心);秦皮乙素对照品 (批号 110741-200506)、菊苣酸对照品 (批号111752-200902)(中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%)。

1.4 样品 二丁颗粒 (批号分别为140201、140202、140203、140204、140301、140302、140303、140304、140305、140501、140502、140503、140504、140505、140506)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 COSMOSIL C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0.01 ～2 min，2% A;2 ～3 min，2% ～15% A;3 ～25 min，15% ～24%A)。体积流量1 mL/min;柱温30 ℃;检测波长336 nm。在此条件下，单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素、菊苣酸与其他组分均有较好的分离，理论塔板数按各峰计算，均不低于2 000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，置于50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得对照品储备液。然后，取贮备液适量加以稀释，制成单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸质量浓度分别为0.004 1、0.061 3、0.005 6 mg/mL 的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取二丁颗粒粉末0.3 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min (300 W、40 kHz)，放冷，70%甲醇补足减失的质量，过0.45 μm 滤膜，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 按二丁颗粒的处方比例称取缺紫花地丁、缺蒲公英、缺紫花地丁和蒲公英的其他药味各一份，根据其生产工艺，分别制成紫花地丁、蒲公英、紫花地丁和蒲公英空白样品，按“2.3”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.5 系统专属性试验 分别吸取混合对照品、供试品和阴性样品溶液20 μL，注入HPLC 色谱仪，在“2.1”项色谱条件下分析。结果，供试品在与对照品色谱图的相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品则无相应峰出现，表明处方中其他成分对三者的测定无干扰，见图1。

2.6 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液适量，注入HPLC 色谱仪，在“2.1”项色谱条件下进样分析，测定对照品峰面积。然后，以峰面积为纵坐标(y)，进样量(μL)为横坐标(x)进行回归计算，得到线性方程，发现均呈良好的线性关系，结果见表1。

表1 线性回归方程Tab.1 Linear regression equations

2.7 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液4 μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次分析，测定色谱峰面积。结果，计算出单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分别为1.2%、0.21%、0.82%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 分别精密吸取同一供试品(批号140503)溶液适量，在“2.1”项色谱条件下分别于0、1、2、5、8、12 h 进样20 μL 分析，测定色谱峰面积。结果，计算出单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分别为1.7%、1.7% 和1.8%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

图1 专属性HPLC 色谱图Fig.1 HPLC specific chromatograms

2.9 重复性试验 取同一批样品(批号140503)适量，按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样20 μL 分析。结果，计算出单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分别为1.0%、0.79%和1.3%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取含有量已知的样品(批号140503)0.3 g，共6 份，按其含各成分80%、100%、120%的量，分别加入单咖啡酰基酒石酸(2.6 μg/mL)5.5、6.6、8.3 mL，秦皮乙素(319 μg/mL)0.669、0.784、0.992 mL，菊苣酸(2.1 μg/mL)对照品溶液3.9、4.5、5.8 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样20 μL 分析，结果见表2，表明该方法回收率良好。

表2 加样回收率试验结果(n=6)Tab.2 Result of recovery tests (n=6)

2.11 检测限与定量限 在“2.1”项色谱条件下，分别精密量取单咖啡酰基酒石酸和菊苣酸对照品适量，逐级稀释进样。最终，确定两者的检测限分别为1.4 和2.2 ng (S/N =3)，定量限分别为8.12 和12.2 ng (S/N ＞10)。

2.12 样品测定 取15 批二丁颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，记录峰面积。然后，以回归方程计算单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的含有量，结果见表3。

表3 样品测定结果(n=4)Tab.3 Result of determination of samples (n=4)

3 讨论与小结

3.1 提取条件的选择 本实验采用单因素变量法，分别对提取方法(冷浸、超声、回流)、提取溶剂(甲醇、乙醇、水)、溶剂比例 (30%、50%、70%甲醇)、提取时间(30、60、120 min)等因素进行考察。结果显示，回流和超声的提取效果优于冷浸，但超声操作更为简便，故选择超声提取方式;甲醇和水的提取效果明显优于乙醇，而且当甲醇体积分数为70%时最佳;超声30 min 后，随着超声时间进一步增加，各成分溶出的程度不再明显增加，故选择提取30 min。最终，确定提取方法为70%甲醇超声提取30 min。

3.2 流动相及检测波长的选择 根据文献［8-12］，本实验比较了甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液这两种流动相，发现后者的分离效果更好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。另外，经HPLC 全波长扫描发现，单咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸的最大吸收波长分别为328、345 和331 nm，由于三者在336 nm 波长下均有较强的吸收，可同时被检测出，故选择336 nm作为检测波长。

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