蔓茎堇菜总三萜的提取工艺优选

2015-01-13闵庆喜冯焕枝曹丽萍戴娇娇朱全红

中成药 2015年2期

闵庆喜，冯焕枝，张琳，曹丽萍，戴娇娇，朱全红

(南方医科大学中医药学院，广东广州510515)

蔓茎堇菜Viola Diffusa G. 为堇菜科堇菜属Viola 植物，又称匍伏堇、天芥菜、茶匙黄、七星莲、黄瓜香、黄瓜草［1-2］。以全草入药，性凉微苦，具有清热解毒、散淤消肿、去腐生肌、清肺止咳之效［3］。民间使用历史悠久，主治疮疡肿毒，眼结膜炎，肺热咳嗽，百日咳，黄疸型肝炎，水火烫伤，跌打损伤，毒蛇咬伤等［2］。现代药理研究表明该植物具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、调节免疫功能、抗心肌缺血等［4-10］药理活性。蔓茎堇菜的化学成分主要有黄酮、萜类、糖类以及黏液质类等成分［1，11-12］。目前蔓茎堇菜的提取工艺研究仅见总黄酮的报道，陈由强等［13］采用紫外-可见分光光度法，以芦丁为对照品测定了蔓茎堇菜总黄酮的量，并对总黄酮的提取工艺进行了初步探讨。本实验室前期对蔓茎堇菜中分离得到的三萜类成分进行了体外抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)活性试验，结果表明三萜类成分具有较好的抗HBV 活性［14］。鉴于此，本实验采用单因素及正交试验的方法，对蔓茎堇菜总三萜成分的提取工艺进行了初步优化研究，以期为蔓茎堇菜总三萜有效部位的研究提供参考。

1 材料与仪器

蔓茎堇菜采自福建省永春县，经南方医科大学中医药学院马骥教授鉴定为堇菜科堇菜属植物蔓茎堇菜Viola diffusa G.，齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号110709-200505，纯度≥99%)，乙酸乙酯、乙醇等均为分析纯。

HP8453 型紫外-可见分光光度计(美国Agilent 公司);JA2003 型天平(上海良平仪器仪表有限公司);CP225D 型电子分析天平(德国Sartorius 公司);DK-S26 型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);TC-15 套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂);DET-200 型粉碎机(浙江大德机械有限公司)。

2 方法与结果

2.1 总三萜的测定方法

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品20.00 mg，置于100 mL 量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.20 mg/mL 齐墩果酸对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备取单因素试验药液或正交试验药液，浓缩至一定量后定容至100 mL 量瓶中，加其提取溶剂至刻度，摇匀即得。

2.1.3 测定波长的选择精密量取对照品溶液0.6 mL 和供试品溶液0.2 mL，置具塞试管中，按文献［12］方法处理，冰浴冷却后，转移至10 mL 量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，再迅速冰浴冷却，放至室温后进行全波长扫描，随行空白对照。结果表明，对照品溶液在560 nm 处有最大吸收峰，故选择560 nm 作为样品测定的波长。

2.1.4 标准曲线的绘制精密量取上述齐墩果酸对照品溶液 0.20、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL，分别置具塞试管中，按“2.1.3”项下处理，于560 nm 波长测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为A =0.031 8C-0.003 6 (r2=0.999 1)，齐墩果酸在0.004 ～0.036 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.2 单因素考察

2.2.1 提取时间考察精密称取4 份蔓茎堇菜，每份约2.0 g，置于圆底烧瓶中，加入90%乙醇50 mL，回流提取2 次，分别提取1、2、4、6 h，过滤，制备供试品溶液，按“2.1.4”项下方法测定总三萜含量。结果总三萜得率分别为1.21、2.64、1.97、1.78 mg/g，表明在提取时间为2 h 时提取物中总三萜的含有量最高，2 h 后含有量下降，这可能是三萜类化合物长时间受热，导致其结构改变而引起的。因此选择回流提取时间为2 h。

2.2.2 溶剂用量考察精密称取5 份蔓茎堇菜，每份约2.0 g，置于圆底烧瓶中，分别加入40、50、60、80，100 mL90%乙醇，回流提取2 次，每次提取2 h，过滤，制备供试品溶液，按“2.1.4”项下方法测定总三萜含有量。结果总三萜得率分别为0.89、1.53、1.96、1.76、1.08 mg/g，表明蔓茎堇菜总三萜含有量随溶剂用量增加而增加，在60 mL 时达到最大，之后缓慢下降。因此选择溶剂用量为60 mL。

2.2.3 提取次数考察精密称取4 份蔓茎堇菜，每份约2.0g，置于圆底烧瓶中，加入90%乙醇50 mL，分别回流提取1、2、3、4 次，每次提取2 h，过滤，制备供试品溶液，按“2.1.4”项下方法测定总三萜含有量。结果总三萜得率分别为2.20、3.79、2.76、2.58 mg/g，表明在提取2 次时，总三萜含有量达到了最大，为3.79 mg/g。从生产工艺的角度考虑，选用2 次。

2.2.4 溶剂体积分数考察精密称取4 份蔓茎堇菜，每份约2.0 g，置于圆底烧瓶中，分别加入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇50 mL，回流提取2 次，每次提取2 h，过滤，制备供试品溶液，按“2.1.4”项下方法测定总三萜的含有量。结果总三萜得率分别为2.20、3.62、5.36、1.33 mg/g，表明随着乙醇体积分数的增加，蔓茎堇菜总三萜的含有量也增加，在乙醇体积分数为90%时达到最大，溶出率最高。所以提取溶剂选择90%乙醇。

2.3 正交试验考察根据单因素试验结果，选取溶剂体积分数、时间、次数3 个影响总三萜含有量的主要因素，每个因素试验3 个水平，进行L9(34)正交试验。因素水平表见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验设计及结果

表3 方差分析

由极差分析可知，三个因素影响总三萜提取率的顺序为A (溶剂体积分数)＞C (提取时间) ＞B (提取次数)。为了检验各因素对提取率影响的显著性，进行了方差分析，利用空白列来估计误差。总三萜的最佳提取工艺为A3B2C1，即80%乙醇提取2 次，每次1.5 h。

2.4 验证试验称取同一批次蔓茎堇菜3 份，按照优选的工艺条件A3B2C1进行验证试验，按“2.1.4”项下方法测定总三萜的量。结果总三萜平均得率为16.87 mg/g，RSD为0.6%。表明优化工艺下提取的总三萜的量最高，此工艺稳定可靠，可行性好。

3 讨论

本实验用乙醇作提取溶剂，以0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸、1.2 mL 高氯酸作为显色剂，采用比色法测定总三萜量，采用正交试验筛选出蔓茎堇菜总三萜的最佳提取条件为80%乙醇提取2 次，每次1.5 h。在测定过程中发现，放热问题对测定结果的稳定性影响较大。因此，需在加热显色后进行冰浴，且定容后放热较多，需再一次迅速冰浴冷却，放至室温后测定。另外，测定时间的同步与否也对试验结果有一定影响。

本实验采用齐墩果酸为对照品进行定量测定，但目前关于蔓茎堇菜化学成分的文献，还未见有齐墩果酸的报道，因此本实验在对照品的选择上存在一定缺陷。但是由于三萜类化合物结构具有相似性，而结构相似的化合物在紫外-可见分光光度计上测得的吸收波长相近，因此，以齐墩果酸为对照品进行定量测定具有参考性。在今后的研究中，课题组将制备出前期实验中从蔓茎堇菜提取得到的具有抗HBV 活性的三萜类化学成分，以此作为对照品对蔓茎堇菜有效部位进行定量测定，准确客观地反映出有效部位中有效成分的含有量。

［1］福建省中医药研究院. 福建药物志:第2 卷［M］. 福州:福建科学技术出版社，1994:11.

［2］国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草:第5册［M］. 上海:上海科学技术出版社，1999:458-459.

［3］福建省科学技术委员会《福建植物志》编写组. 福建植物志:第4 卷［M］. 福州:福建科学技术出版社，1990:2.

［4］莫汝定，朱天倬. 黄瓜香对外伤感染的疗效试验［J］. 湖南农学院学报，1991，17(1):95-98.

［5］胡玉红，吴庆田，张凯，等. 微生态调节剂黄瓜香治疗细菌性阴道炎疗效观察［J］. 中国微生态学杂志，2009，21(12):1110-1111.

［6］李春艳，钟飞，李先辉，等. 黄瓜香在急性炎症动物模型中抗炎效应的研究［J］. 时珍国医国药，2010，21(4):844-845.

［7］李先辉，李春艳，吕江明，等. 黄瓜香水提物体外抗氧化活性实验［J］. 吉首大学学报:自然科学版，2006，27(5):95-97.

［8］张军，李先辉. 黄瓜香提取物对大鼠酒精性肝损伤氧化应激的实验研究［J］. 中国中西医结合消化杂志，2010，18(4):247.

［9］李春艳，李先辉，吕江明，等. 黄瓜香对小鼠免疫功能调节的实验研究［J］. 时珍国医国药，2008，19(1):40-41.

［10］彭湘萍，彭振宇，彭英福，等. 黄瓜香对大鼠急性心肌缺血的保护作用［J］. 中国心血管病研究，2011，9(12):943-945.

［11］陈由强，林国宇，代容春. 蔓茎堇菜总黄酮含量的测定［J］. 福建师范大学学报:自然科学版，2000，16(4):67-69.

［12］戴娇娇，陶华明，朱全红，等. 蔓茎堇菜总黄酮和总三萜的含量测定［J］. 中国现代应用药学，2012，29(2):166-169.