蒺藜总皂苷对缺血再灌注损伤大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响

王 璟，卢 敏

(广东佛山市山水区人民医院眼科，广东 佛山 528100)

蒺藜(Tribulus terrestris L)是一种中草药植物，在我国民间用药由来已久。研究表明蒺藜的提取物蒺藜总皂苷(gross saponin from Tribulus terrestris L，GSTT)具有有抑制血栓形成、抗血小板聚集、改善血液流变学、抗脑缺血及改善脑缺血部位的血流量、抗心肌缺血缺氧、减轻心脑缺血、缺氧损伤的作用［1，2］，临床治疗一般用于缺血性心脑血管疾病。本文旨在探讨蒺藜总皂苷在视网膜缺血再灌注损伤中的作用，为临床应用提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年健康雄性SD 大鼠25 只，体质量180～250g，清洁级，由武汉大学实验动物中心提供。将入选动物分为对照组(Con)5 只、缺血再灌注组(IR)10 只和蒺藜总皂苷治疗组(GSTT)10 只。

1.2 实验方法 对照组不做特殊处理，IR组和GSTT组均以前房加压法建立缺血再灌注模型［3］，并分别于缺血前24h 尾静脉注射等量生理盐水和蒺藜总皂苷(30mg/kg)。再灌注48h 后迅速处死动物，摘除眼球，显微镜下剥离视网膜。

1.3 检测方法

1.3.1 Western blot 法检测cyclin D1 和CDK4 蛋白组织匀浆后提取蛋白，采用Bradford 法［4］测定蛋白含量。SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用0.2%TTBS 洗膜，5%脱脂奶粉封闭1h，加入1∶200兔多克隆cyclin D1 和CDK4 一抗(美国Santa Cruz公司产品)于4℃下孵育过夜;用0.2%TTBS 洗膜，加入HRP 抗兔二抗于37℃下孵育1h;在暗室中采用化学发光法显影，应用Kodak 图像分析系统处理免疫印迹条带得出条带光密度，结果以相对密度表示(相对密度=各组条带平均光密度/对照组平均光密度)。

1.3.2 流式细胞计数检测细胞凋亡 将组织剪碎后，用胰蛋白酶于37℃下消化，然后等量生理盐水终止消化，经200 目筛网过滤，离心，PBS ×2洗，细胞数调整为1 ×106/ml，Annxin V/PI 双标检测细胞凋亡。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数。

2 结果

2.1 cyclin D1 和CDK4 的表达 与对照组相比，缺血再灌注组cyclin D1(2.256 ±0.072)和CDK4(1.678 ±0.104)蛋白表达明显升高(P ＜0.01);与缺血再灌注组比较，蒺藜总皂苷治疗组cyclin D1(1.302 ±0.103)和CDK4(1.196 ±0.126)蛋白表达明显降低(P ＜0.05 或0.01)，见表1、图1。

表1 各组cyclin D1 和CDK4 蛋白相对密度及细胞凋亡率比较()

表1 各组cyclin D1 和CDK4 蛋白相对密度及细胞凋亡率比较()

与Con组相比，* P ＜0.01;与IR组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

图1 视网膜缺血再灌注48h 后cyclin D1 和CDK4 蛋白表达

2.2 细胞凋亡情况 与对照组相比，缺血再灌注组细胞凋亡率(0.376 ±0.050)显著升高(P ＜0.01)，蒺藜总皂苷治疗后细胞凋亡率(0.229 ±0.045)明显下降(P ＜0.05)，见表1，图2。提示蒺藜总皂苷能够抑制凋亡。

图2 视网膜缺血再灌注48h 后细胞凋亡率

3 讨论

青光眼、视网膜中央动脉栓塞等疾病均可导致缺血再灌注损伤的发生，损伤后视网膜神经细胞的凋亡是视觉功能损害的一个主要原因。近来研究表明有两种不同的机制调控正常发育的神经细胞凋亡，一种是经典的Caspase 通路，另一种涉及细胞周期蛋白［5］。细胞从G1 期进入S 期的关键因子是细胞周期素D1(cyclin D1)和细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)。研究发现在大鼠局灶性脑缺血和全脑缺血后cyclin D1 和CDK4 表达明显增加，1～2d 达到高峰，而凋亡高峰发生在缺血后2～3d［5，6］。应用CDK 抑制剂可以抑制脑缺血后的神经元凋亡［7］。神经细胞是不能进行增殖分裂的，cyclin D1 和CDK4 表达升高出现在缺血后的神经细胞，作用可能是直接启动了神经细胞的凋亡，而不是发挥其细胞周期中的作用。缺血后神经保护作用的途径之一有望通过对细胞周期蛋白进行调控来实现。在本研究中，视网膜缺血再灌注后cyclin D1 和CDK4 蛋白表达升高，凋亡细胞增多，表明视网膜缺血再灌注后异常表达的cyclin D1 和CDK4 蛋白能够促进凋亡。

蒺藜总皂苷对心、脑缺血有较好的治疗作用，对心、脑缺血引起的凋亡有明显的抑制作用，其机制主要是抑制血栓形成、抗血小板聚集、改善血液流变学、抗脑缺血及改善脑缺血部位的血流量和抗心肌缺血缺氧。在本研究中，蒺藜总皂苷使视网膜缺血再灌注后神经元凋亡率下降，同时使cyclin D1、CDK4 蛋白表达降低，提示蒺藜总皂苷对cyclinD1 和CDK4 的调控作用可能是蒺藜总皂苷抑制视网膜缺血再灌注损伤神经元凋亡的机制之一。

［1］侯俊英，王秀华，李红，等.蒺藜皂苷对缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用［J］.中国药理学通报，2004，20(4):418

［2］姜宗文，吕文伟，张志强，等.蒺藜果总皂苷对大鼠实验性脑缺血的保护作用［J］.中草药，2002，33(11):1020

［3］牛膺筠，张瑞，周占宇，等.碱性成纤维细胞生长因子对鼠视网膜缺血再灌注损伤的治疗作用［J］.中华眼科杂志，2012，38(9):530

［4］Li Y，Chopp M，Powers C，et al.Immunoreactivity of cyclin D1/cdk4 in neurons and oligodendrocytes after focal cerebral ischemia in rat［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1997，17(8):846

［5］Lossi L，Gambino G，Mioletti S，et al.In vivo analysis reveals different apoptotic pathways in pre-and postmigratory cerebellar granule cells of rabbit［J］.J Neurobiol，2004，60(4):437

［6］Timsit S，Rivera S，Ouaghi P，et al.Increased cyclin D1 in vulnerable neurons in the hippocampus after ischemia and epilepsy:a modulator of in vivo programmed cell death［J］.Eur J Neurosci，1999，11(1):263

［7］Osuga H，Osuga S，Wang F，et al.Cyclin-dependent kinases as a therapeutic target for stroke［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(18):10254