青海干旱生境土壤链霉菌次级代谢产物的分离鉴定及活性研究

余志银，喻明明，罗剑英，苏 灿，薛泉宏，黄胜雄，孙 芸，马亚团，*

1 新疆医科大学中药系，乌鲁木齐 830011;2 中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，昆明 650201;3 西北农林科技大学理学院，杨凌 712100

链霉菌是一类高G+C 含量的革兰氏阳性放线菌，广泛分布于土壤、海洋、极端环境及一些生物体内［1］。链霉菌代谢途径复杂，能够产生许多结构新颖的次级代谢产物，在医疗、农业、食品、化工、环保等领域具有重要应用价值，是新天然活性物质的重要源泉。如最著名的生物农药阿维菌素(Avermectins，简称Avm)，由美国Merek 公司于1976 年在日本Kitasato 研究所提供的Streptomyces avermitilis 发酵物中发现。其作为一种高效广谱驱虫剂，不仅对线虫而且对蜱螨类(Acarina)、甲虫类(Coleoptera)、磷翅目(Lepidoptera)、直翅目(Orthoptera)、双翅目(Diptera)和膜翅目(Hymenoptera)害虫均有杀灭作用。其它从链霉菌中发现的生物农药还有井冈霉素、春雷霉素、农抗120、中生菌素等［2］。然而这些生物农药的广泛使用导致严重的药物抗性问题，故寻找新的潜在的生物农药就显得至关重要。

番茄作为一种世界性蔬菜作物，其病害番茄灰霉病、番茄早疫病已成为影响番茄种植和品质的主要因素［3-5］。为了寻找新的抗植物病原菌天然活性物质，本课题组对多株链霉菌的发酵产物进行了活性筛选，得到一株具有较好抑菌活性的链霉菌KIBHL8。因此，我们扩大了该菌株的发酵规模，对发酵液中的次级代谢产物进行提取分离，得到了5 个化合物，结构分别鉴定为:N-乙酰酪胺(1)、N-乙酰色胺(2)、吡咯-2-甲酰胺(3)、Inthomycin C(4)和Inthomycin B(5)(见图1)，并对其抗真菌和抗细菌活性进行筛选，旨在确定其中的抗菌活性成分。

图1 化合物1～5 的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 1-5

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Bruker DRX-500、Avance Ⅲ-600 核磁共振仪(TMS 作为内标，δ 为ppm)，Waters Xevo TQ-S 型超高压液相三重四极杆联用质谱仪;ZQZY-HC 恒温摇床(上海知楚仪器)，薄层色谱硅胶板和200-300 目柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)，Sephadex LH-20(瑞典AIRTECH 生物化学试剂公司生产)，Hitachi Chromaster 5430 高效液相色谱仪(日立)，YMC-Triat C18型液相色谱柱(250×10 mm I.D.)，中速滤纸(杭州新华纸业有限公司)，YXQ-LS-18SI 高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。其他试剂为国产分析纯试剂(天津市大茂化学试剂厂，广东环凯微生物科技有限公司)。

1.2 发酵菌株

发酵菌株Streptomyces pactum KIB-HL8 由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室薛泉宏教授课题组提供，菌株分离自青海干旱土壤样本(海西蒙古族藏族自治州德令哈市，东经93°06＇40.6″～96°22＇14.9″，北纬35°57＇54.2″～ 37°15＇09.8″)。通过对其16S RNA 进行基因测序，发现其序列与Streptomyces pactum AB184398，Streptomyces olivaceus AB249920 的序列相似度分别是99.4% 和99.3%，故将其初步鉴定为密旋链霉菌(S.pactum)。菌株KIB-HL8 保藏于昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室。

1.3 培养基及培养条件

固体培养基:为MS 培养基，配方为大豆粉20.0 g/L(煮沸过滤取滤液)，甘露醇20.0 g/L，技术琼脂粉20.0 g/L，pH=7.0。

种子培养基:为TSB 培养基，配方为胰蛋白胨17.0 g/L，大豆蛋白胨3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.5 g/L，右旋葡萄糖2.5 g/L，pH=7.3±0.2。

发酵培养基:胰蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉12.0 g/L，玉米浆7.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，CaCO32.0 g/L，NaCl 4.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO41.0 mg/L，MnCl21.0 mg/L，ZnSO41.0 mg/L，pH=7.5-7.8。

PDA:200.0 g 去皮土豆切碎，加入1.0 L 水，煮沸30 min，用四层纱布过滤除，滤液定容到1.0 L，加20.0 g 琼脂粉，加热搅拌使其溶解，再加20.0 g 葡萄糖。

LB:胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，技术琼脂粉20.0 g/L，pH=7.4。

将在MS 平板上活化好的菌株接种到20 只装有50 mL 种子液的250 mL 三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm 摇床上培养2 d。

将种子液按10%接种量转接到60 只盛有250 mL 发酵培养基的1 L 三角瓶中，置于28 ℃，220 rpm 摇床上培养7 d。

1.4 提取与分离

将发酵液于6000 rpm 转速下离心20 min。上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3 次，用无水硫酸钠干燥，有机相减压浓缩后得1.5 g 粗提物。经硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(10∶0、10∶1、10∶2、0∶10)，得到四个组分(Frs.A-D)。Frs.B 段过凝胶色谱Sephadex LH-20，甲醇洗脱，TLC 分析，得到3 个组分(Frs.B 1-3)。用HPLC 分析后，Frs.B-2段用高效液相色谱制备，用28%～100%甲醇-水梯度洗脱，富集20.2 min 的流份得化合物1(57 mg)，富集37.1 min 的流份得化合物4(1.4 mg)，富集41.3 min 的流份得化合物5(1.0 mg);Frs.B-3 段用高效液相色谱制备，以50%的甲醇-水等度洗脱，富集12.5 min 的流份得化合物2(6.2 mg)。Frs.C段经过Sephadex LH-20(甲醇洗脱)后，TLC 分析，得到3 个组分(Frs.C 1-3)，用HPLC 分析后，Frs.C-2段用HPLC 制备，以15%的甲醇-水等度洗脱，富集16.5 min 的流份得化合物3(14 mg)。

1.5 活性测试(滤纸片法)

将保存于石蜡油中的测试菌株番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、小麦赤霉病菌(Gibberella saubinetti)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporiodes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)、马铃薯干腐病菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、苹果腐烂病(Valsa mali Miyabe et Yamada)分别接种至PDA 培养基上活化培养，28 ℃避光培养4 d，待其菌落基本长满培养皿为止即可用。将保存于甘油中的测试菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)接种至LB 培养基上活化培养，28 ℃避光培养12 h，待其菌落基本长满培养皿为止即可用。

化合物1、2、3、4、5 和卡那霉素均配制成浓度为2.0 mg/mL 的丙酮溶液备用。

取无菌滤纸片(用打孔器将滤纸片加工成直径为5 mm)，滴上10 μL 样品溶液，待溶剂挥干后移入已接菌的培养基平板上，培养皿中心到滤纸片中心的距离约为30 mm 左右，金黄色葡萄球菌放在37℃培养12 h，其他菌株放在28 ℃培养24 h 后观察抑菌圈大小，用十字交叉法测量抑菌圈直径。以空白对照长至滤纸片为依据，测量菌落边缘到滤纸片的距离。测试时以无菌水和丙酮为阴性对照，以卡那霉素为阳性对照，每块平板中都需有阳性对照［6］。重复平行做3 次，抑菌圈直径测量3 次求平均值。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1 无色粉末;分子式C10H13NO2;ESIMS m/z:180［M+H］+;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:7.00(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6)，6.72(2H，d，J=8.5 Hz，H-3，H-5)，3.31(2H，t，J=7.5 Hz，H-7)，2.66(2H，t，J=7.5 Hz，H-8)，1.88(3H，s，CH3);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:22.6(CH3)，35.7(C-8)，42.6(C-7)，116.3(C-3，C-5)，130.8(C-2，C-6)，131.3(C-1)，156.9(C-4)，173.25。以上数据与文献报道一致［7］，故鉴定为N-乙酰酪胺。

化合物2 浅褐色油状物;分子式C12H14N2O;ESI-MS m/z:225［M+Na］+，［M+H］+203;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.55(1H，d，J=7.8 Hz，H-4)，7.32(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)，7.08(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，7.06(1H，m，H-5)，7.00(1H，m，H-2)，3.46(2H，t，J=7.2 Hz，H-9)，2.93(2H，t，J=7.2 Hz，H-8)，1.91(3H，s，CH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:173.4(C-1＇)，138.3(C-7a)，128.9(C-3a)，123.5(C-2)，122.4(C-6)，119.7(C-5)，119.4(C-4)，113.4(C-3)，112.4(C-7)，41.7(C-9)，26.4(C-8)，22.7(CH3)。以上数据与文献报道一致［8］，故鉴定为N-乙酰色胺。

化合物3 白色粉末;分子式C5H6N2O;ESI-MS m/z:111［M+H］+;1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ:6.91(1H，dd，J=2.5，1.5 Hz，H-5)，6.80(1H，dd，J=3.5，1.5 Hz，H-3)，6.15(1H，dd，J=3.5，2.5 Hz，H-4);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ:165.9 C-6)，126.4(C-2)，123.3(C-5)，112.9(C-3)，110.3(C-4)。以上数据与文献报道一致［9］，故鉴定为吡咯-2-甲酰胺。

化合物4 黄色油状物;分子式C16H22N2O3;ESI-MS m/z:291［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:7.79(1H，s，H-13)，6.80(1H，s，H-12)，6.39(1H，dd，J=11.4，14.2 Hz，H-6)，6.23～6.18(3H，m，H-8，H-7，NH)，6.02(1H，d，J=11.4 Hz，H-5)，5.76(1H，m，H-9)，5.44(1H，brs，NH)，4.0(1H，brs，H-3)，3.80(1H，brs，OH)，3.49(2H，d，J=4.8 Hz，H-10)，1.79(3H，s，4-CH3)，1.30(3H，s，2-CH3)，1.11(3H，s，2-CH3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:180.6(C-1)，150.8(C-11)，150.4(C-13)，137.9(C-4)，133.4(C-8)，132.4(C-7)，128.8(C-5)，128.0(C-6)，127.4(C-9)，122.5(C-12)，83.8(C-3)，44.9(C-2)，28.9(C-10)，25.7(2-CH3)，21.7(2-CH3)，13.3(4-CH3)。以上数据与文献报道一致［10］，故鉴定为Inthomycin C。

化合物5 黄色油状物;分子式C16H22N2O3;ESI-MS m/z:291［M+H］+;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:8.09(1H，s，H-13)，6.85(1H，s，H-12)，6.56(1H，dd，J=13.8，11.4 Hz，H-6)，6.26(1H，dd，J=15.0，10.8 Hz，H-8)，6.16(1H，dd，J=13.8，10.8 Hz，H-7)，6.01(1H，d，J=11.4 Hz，H-5)，5.76(1H，dt，J=15.0，7.2 Hz H-9)，4.68(1H，s，H-3)，3.51(2H，d，J=7.2 Hz，H-10)，1.79(3H，s，4-CH3)，1.25(3H，s，2-CH3)，1.05(3H，s，2-CH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:183.4(C-1)，153.1(C-13)，152.8(C-11)，139.3(C-4)，134.8(C-8)，132.9(C-7)，130.9(C-5)，129.2(C-6)，128.2(C-9)，122.7(C-12)，75.9(C-3)，46.7(C-2)，29.4(C-10)，26.3(2-CH3)，21.9(2-CH3)，19.8(4-CH3)。以上数据与文献报道一致［11］，故鉴定为Inthomycin B。

2.2 化合物抑菌活性结果

通过对10 株病原菌株的测试，发现化合物4 对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)有抑制活性，对其他所测试病原菌没有活性;化合物1 和2 对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有抑制活性，对其他所测试病原菌没有活性;化合物3 对番茄早疫病菌(Alternaria solani)有较强的抑制活性，对其他所测试病原菌没有活性;化合物5 对所测试病原菌均无活性(见表1)。

表1 化合物1～5 抑菌圈直径(mm)Table 1 The diameter of inhibition zone of compounds 1-5(mm)

3 讨论

本研究从链霉菌Streptomyces pactum KIB-HL8发酵液中分离得到5 个化合物，其中化合物1 由Sobolevskaya 等人报道具有细胞毒活性，可以抑制海胆胚胎细胞的增值［12］。化合物2 由张文娟等人报道对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用如蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，对革兰氏阴性菌无明显活性［13］。另外Inthomycin 类化合物是一种恶唑三烯类抗生素，Uemura等人在1985 年首次报道了恶唑霉素A 和新的恶唑霉素，这类抗生素具有广谱、有效的抗菌、抗病毒，抗肿瘤活性［10］。1990 年ōmura 等人从链霉菌中首次分到Inthomycin A 和异构体Inthomycin B、Inthomycin C。这类化合物是一种高度特异性纤维素生物合成抑制剂，并具有很强的抗菌活性和除草活性［10］。中国是番茄出口大国，番茄种植面积约145.5 万hm2，保护地栽培面积已达21.7 万hm2，年产量约837.6 万吨且以每年6%～8%的速度增长，与此同时番茄上的各种病害也在逐年增加［14］。本实验首次发现化合物1 和2 对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)有抑制活性，化合物3 对番茄早疫病菌(Alternaria solani)有较强的抑制活性，这为开发新型抑制番茄病害的生物农药提供理论和数据指导。

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