定抽颗粒对抽动障碍模型小鼠行为学及氨基酸类神经递质的影响

朱先康解莹晶赵 艳

（1.南京中医药大学附属医院儿科，江苏南京210029；2.南京中医药大学，江苏南京210029）

定抽颗粒对抽动障碍模型小鼠行为学及氨基酸类神经递质的影响

朱先康1解莹晶2赵 艳2

（1.南京中医药大学附属医院儿科，江苏南京210029；2.南京中医药大学，江苏南京210029）

目的：探索定抽颗粒治疗儿童抽动障碍的作用机制。方法：72只ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、氟哌啶醇组和定抽颗粒高、中、低剂量组，每组12只。除正常对照组外，其余各组小鼠予亚氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射诱导抽动障碍模型。造模当日起，正常对照组和模型组给予蒸馏水，其余组每日分别给予氟哌啶醇 （1.38mg/kg）、定抽颗粒（5.76g/kg、2.88g/kg、1.44g/kg），连续灌胃3周。末次给药后1h进行刻板行为、运动行为、自主活动测定，翌日采用高效液相色谱法检测血浆及脑组织中γ-氨基丁酸（GABA）、天门冬酸（ASP）、谷氨酸（GLU）含量。结果：定抽颗粒各剂量组小鼠刻板行为、运动行为评分和自主活动次数均明显低于模型组（P＜0.01，P＜0.05）。模型组小鼠脑组织及血清中GABA含量明显低于正常对照组（P＜0.01），脑组织中GLU、ASP含量明显高于正常对照组（P＜0.01）；定抽颗粒各剂量组脑组织、血清中GABA含量明显高于模型组（P＜0.01），脑组织中GLU、ASP含量明显低于模型组（P＜0.01）。结论：定抽颗粒可明显改善抽动障碍模型小鼠行为学改变，其可能的作用机制与抑制兴奋性氨基酸类神经介质、兴奋抑制性氨基酸类神经递质有关。

抽动障碍 定抽颗粒 氨基酸类神经递质 行为学 ICR小鼠

儿童抽动障碍临床较为常见，近年来发病率逐渐增高。现代医学对于抽动障碍的病因及发病机制尚不明确，多数学者认为与遗传因素、神经递质失衡、心理因素、某些病理因素（感染后自身免疫反应、围生期产伤、难产等）有关。关于神经递质失衡学说，近年来有学者提出儿童抽动障碍发病可能与兴奋性氨基酸含量过多，抑制性氨基酸含量过少有关[1]。兴奋性氨基酸包括谷氨酸（glutamic acid，GLU）和门冬氨酸（Aspartate，ASP），抑制性氨基酸主要为γ-氨基丁酸（Gamma-Amino-Butyric Acid，GABA）。近十余年来，我们研制了定抽颗粒治疗儿童抽动障碍，前期临床研究疗效确切[2]，但其作用靶点尚不明确。因此本实验研究采用高效液相色谱法测定抽动障碍模型小鼠脑组织GLU、ASP、GABA及血清GABA的含量变化，观察定抽颗粒调节氨基酸类神经递质的作用，探索其治疗儿童抽动障碍的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 ICR小鼠72只，清洁级，16～20g，雄性，购于浙江省实验动物中心，许可证号:SCXK（浙）2008-0033。

1.2 实验药物 定抽颗粒（胆南星6g、天麻12g、石菖蒲12g、柴胡6g、菊花6g、钩藤10g、郁金10g、炙远志6g、生地10g、炒白芍10g），由江阴天江药业有限公司提供。氟哌定醇，由上海信谊九福药业有限公司提供，批准文号:国药准字H31021234。亚氨基二丙腈（IDPN，90%），由上海至鑫化工有限公司提供。

1.3 实验试剂 甲醇为色谱醇，由江苏汉邦科技有限公司提供；曲唑酮、丹酰氯、醋酸钠、庚烷磺酸钠、四氢呋喃，由南京赛研科技有限公司提供；丙酮、高氯酸，由南京化学试剂有限公司生产。谷氨酸、天门冬氨酸、γ-氨基丁酸标准品，均购自美国sigma公司。实验用水为双蒸水。

2 实验方法

2.1 抽动障碍小鼠模型的建立 在前期课题研究中，我们对小鼠腹腔注射IDPN成功诱导了抽动障碍模型[2]，本次实验我们也采用同样方法造模。IDPN溶于生理盐水中，使其终浓度为22mg/mL，每只小鼠每日腹腔注射IDPN 330mg/kg，连续注射7d。正常对照组腹腔注射等量生理盐水7d。

2.2 分组与给药 ICR小鼠72只，随机分为正常对照组、模型组、氟哌啶醇组和定抽颗粒高、中、低剂量组，每组12只。自造模当日起，正常对照组与模型组灌胃蒸馏水20mL/（kg·d），定抽颗粒高、中、低剂量组灌胃定抽颗粒5.76、2.88、1.44g/（kg·d），氟哌啶醇组 （阳性对照药组）灌胃氟哌啶醇1.38mg/（kg·d），各组均连续灌胃3周。

2.3 观察指标

2.3.1 刻板行为评分 将动物放入一较大的观察笼内，动物适应5min后，以Diamond等[3]抽动障碍动物模型中对刻板行为的评分方法，在最后一次给药后1h，进行双盲观察1h，每5min记录1次，统计总分。0分:无刻板行为；1分:旋转行为；2分:头和颈部的上下运动过多；3分:头、颈部的上下运动过多加旋转行为；4分:头向侧摆合并头和颈部的上下运动过多。

2.3.2 运动行为评分 刻板行为评分结束后，立即将动物放入一较大的观察笼内，动物适应5min后，以抽动障碍动物模型中对运动行为的评分方法，观察1h，每5min记录1次，统计总分。0分:安静或正常活动；1分:过度兴奋；2分:探究行为增加；3分:跑；4分:跑和跳。

2.3.3 自主活动次数统计 参照Wei等[4]报道的方法，于运动行为评分结束后立即应用小鼠自主活动程序仪进行小鼠自发活动计数，当计算机进入测定程序后，将小鼠放入活动箱中（高13cm，直径25cm），由计算机自动记录小鼠活动情况，测定每只小鼠5min内的活动次数。

2.3.4 脑组织及血清GLU、ASP、GABA的含量测定

末次给药后夜间禁食不进水，翌日清晨采集脑组织、血浆样本。用眼科镊摘取小鼠眼球取眼眶血于离心管中并标号；取血后立即将小鼠颈椎脱臼处死，并在冰碟上迅速剥离出大脑组织，将脑组织放入冻存管并标号，迅速放入液氮中保存待测。标本采集完后取出液氮中保存脑组织的冻存管，放入-80℃冰箱保存。将装有小鼠眼眶血的EDTA抗凝管置于离心机内离心（3000r/min，10min，4℃），离心后取上清液，置于-80℃冰箱保存。处理脑组织样品:取脑组织置于10mL圆头离心管中，加入2～3mL 0.4mmol/L高氯酸，于匀浆机匀浆7min，用少量高氯酸清洗匀浆机，洗液并入离心管后置于离心机离心（10000r/min，10min，4℃），取上清液备用。衍生化反应:吸取脑组织匀浆上清液 250μL于 10mL离心管中，加入40μL内标液曲唑酮，再加入100μL KHCO3，最后再加入200μL衍生试剂丹酰氯，置于80℃水浴30min，取出后加入100μL醋酸丙酮，冷却后过0.23μm滤膜装样，进样量20μL。使用高效液相色谱仪分别测定脑组织及血清中GLU、ASP、GABA含量。

2.4 统计学方法 本研究均使用SPSS17.0软件进行统计学处理，数据用（±s）表示。

3 实验结果

3.1 各组小鼠刻板行为、运动行为评分及自主活动次数比较 见表1。实验结果表明，模型组小鼠刻板行为、运动行为评分均明显高于正常对照组（P＜0.01），提示本次实验造模成功。定抽颗粒各剂量组与氟哌啶醇组一样，均可以明显降低IDPN诱导的抽动障碍模型小鼠刻板行为、运动行为评分及自主活动次数（P＜0.01，P＜0.05）。

表1 各组小鼠刻板行为、运动行为评分及自主活动次数比较（±s）

表1 各组小鼠刻板行为、运动行为评分及自主活动次数比较（±s）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 动物数（只）刻板行为评分（分）运动行为评分（分）正常对照组剂量12自主活动次数（次）0 0162.87±59.78 12氟哌啶醇组 12 1.38mg/kg 8.53±5.32△△10.67±9.12△△92.80±33.13△△定抽颗粒高剂量组 12 5.76g/kg 11.33±6.66△△15.33±6.17△△76.80±26.03△△定抽颗粒中剂量组 12 2.88g/kg 9.60±8.59△△14.53±4.81△△97.67±31.70△△定抽颗粒低剂量组 12 1.44g/kg 12.00±13.54△13.20±8.58△△82.40±25.46△△模型组 22.93±10.47##26.13±10.01##173.80±66.52

表2 各组小鼠血清及脑组织GLU、ASP、GABA含量比较（±s） μg/mL

表2 各组小鼠血清及脑组织GLU、ASP、GABA含量比较（±s） μg/mL

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与氟哌啶醇组比较，**P＜0.01；-表示未测出。

血清 脑组织组别 动物数 剂量GLUASP GABA GLU ASP GABA正常对照组 12-- 56.5083±11.77142 12.3433±5.1337851.8967±11.38978 6.3292±1.98249模型组 12氟哌啶醇组 12 1.38mg/kg - 36.7575±4.42748##42.7475±11.12761##- - 72.4450±3.38363△△8.3950±6.02136△△50.7050±7.75965△△4.9067±1.90961△△-144.8167±71.55752##1.1525±0.46276##定抽颗粒高剂量组 12 5.76g/kg定抽颗粒中剂量组 12 2.88g/kg - - 93.6083±7.80099△△**2.8167±1.45843△△53.3917±8.26234△△6.8058±2.26837△△- - 78.9525±8.24751△△3.3825±2.63765△△61.6508±15.27055△△5.1292±1.83260△△定抽颗粒低剂量组 12 1.44g/kg - - 65.7400±7.54871△△13.7992±8.28707△△46.3100±4.01259△△3.7850±2.53203△△

3.2 各组小鼠血清 GLU、ASP、GABA及脑组织GABA含量比较 见表2。与正常对照组相比，模型组小鼠血清及脑组织GABA含量显著降低（P＜0.01），脑组织GLU、ASP含量明显升高 （P＜0.01），说明IDPN所致的抽动障碍模型小鼠体内存在着3种氨基酸类神经递质含量的变化，由此推测抽动症的发病与GLU、ASP、GABA的含量失衡有关。与模型组比较，定抽颗粒各剂量组、氟哌啶醇组小鼠脑组织GLU、ASP含量明显降低，血清和脑组织GABA含量明显升高（P＜0.01）。由此推测定抽颗粒、氟哌啶醇的作用机制是调整抽动障碍小鼠体内各类氨基酸类神经递质含量的平衡。与氟哌啶醇组相比，定抽颗粒高剂量组小鼠血清GABA含量明显升高（P＜0.01），其余指标定抽颗粒各剂量组与氟哌啶醇组比较无统计学差异，因此在改善氨基酸类神经递质方面定抽颗粒与氟哌啶醇效果相当。

4 讨论

儿童抽动障碍是一种比较常见的，由于遗传缺陷和不良环境因素所致的，儿童时期起病的慢性神经精神障碍性疾病，以慢性运动性抽动和（或）发声性抽动为特征，患儿常伴有注意力不集中及强迫行为等，严重时可出现暴躁情绪或孤独少语、学习困难、不能上学等情况。本病的发病可能与神经递质失衡及受体异常有关，西医临床首选的治疗药物是氟哌啶醇。氟哌啶醇为多巴胺受体阻滞剂，可阻断脑内多巴胺受体，并可促进脑内多巴胺的转化，从而达到治疗抽动障碍的目的。

中医认为本病多与先天禀赋不足、产伤、窒息、感受外邪、情志失调等因素有关，多因五志过极、风痰内蕴而引发，病位主要在肝，涉及心、脾、肾三脏。近年来众多学者提出肾虚肝旺、风痰阻络、脾虚肝旺、心脾两虚等病机观点，对临床治疗有着重大的指导意义。根据我们多年诊疗经验，认为抽动症的分型虽多，但临床最为常见的尚属肾虚肝旺、风痰阻络，故研制出针对此证型的定抽颗粒。方中以生地、天麻、钩藤为君药。生地滋养肾阴，“壮水之主以制阳光”，滋水可涵木，从而抑制肝阳；天麻息风平肝，钩藤味甘凉，有清热平肝之效，二者均属肝经，共用可达平肝息风之效。柴胡、郁金为临床常用疏肝解郁之药，二者共用有助天麻、钩藤平肝之效，均为臣药。胆南星是制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁加工而成，或为生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成，性苦寒，微辛，石菖蒲辛苦，性温，二药同用，有涤痰开窍之效。远志祛痰开窍，有助胆南星、石菖蒲涤痰之功；菊花可清肝平肝；白芍酸以敛阴，苦寒以平肝，有敛阴平肝之效，同时有调和诸药的作用。此外，本病患儿临床多见心神不宁等表现，郁金、远志相配有清心安神之效。生地、白芍相配，既滋养肾阴，又敛虚跃浮阳。诸药合用，使得肝肾之阴得以养，肝之阳亢得以制，风痰得以祛，共奏滋肾平肝、息风涤痰之效。

兴奋性氨基酸包括GLU和ASP，是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。GLU是哺乳动物脑内含量最高的氨基酸，存在于相关神经元及突触中，集中于海马、大脑皮质外层和脊髓胶状质中。GLU由三羧酸循环合成或谷氨酰胺脱氨基而产生，在神经突触终末去极化时释放入突触间隙。GLU释放后与不同的特异性受体结合，产生不同突触后反应。作为主要的兴奋性氨基酸类神经递质，GLU通过特异性受体介导认知、学习、记忆等高级神经活动。兴奋性氨基酸不但可以通过与相应的受体结合参与中枢神经信息传递，还可作为内源性兴奋毒素破坏中枢神经细胞，导致神经功能障碍。谷氨酸通过N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）受体参与调节纹状体刻板行为，将谷氨酸直接注入纹状体可以诱导动物出现旋转行为。这种改变可能是由于谷氨酸含量的增加对神经细胞产生毒性作用。ASP也是脑内重要的兴奋性氨基酸，在脊髓主要集中于灰质背侧。ASP大多经GLU转氨基作用生成，其分解代谢与GLU类似。GABA是脑内主要的抑制性神经递质，在中枢的含量非常高。实验研究证实GABA有对抗兴奋性氨基酸的作用及减轻缺血时对兴奋神经细胞的毒性作用[5]。

本研究表明，抽动障碍模型小鼠脑组织及血清中GABA的含量均有下降，脑组织中GLU、ASP的含量有提升，据此我们推测，脑组织中兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸含量的失衡可能是引起抽动障碍的原因之一。此外，定抽颗粒、氟哌啶醇均能提高脑组织及血清中GABA含量，降低脑组织中GLU、ASP含量，提示定抽颗粒、氟哌啶醇治疗抽动障碍可能的机制之一是抑制兴奋性氨基酸类神经介质、兴奋抑制性氨基酸类神经介质。

本次实验的动物造模，根据动物的刻板行为、运动行为、自主活动计数评分来看，抽动障碍症的造模是基本成功的，但能否对应于肾虚肝旺、风痰阻络的证型，还有待进一步研究。定抽颗粒是临床上治疗抽动症肾虚肝旺、风痰阻络证型的有效方药，在实验中建立病证结合的动物模型，对于中医药实验研究来说是一个极大的考验。

[1] 刘智胜，静进.儿童心理行为障碍.北京：人民卫生出版社，2007：143

[2] 朱先康，韩新民，王敏华.定抽颗粒治疗小儿多发性抽动症的临床及实验研究.中华中医药杂志，2011，26（2）：399

[3] Diamond B I，Reyes M G，Borison R.A new animal model for Touretee syndrome.AdvNeurol，1982，35：221

[4] Haifeng Wei，Lin Li，Qiujuie Song，et al.Behavioral study of the D2 galactose induced aging model in C57B L/6J mice.Behav Brain Res，2005，157（2）：245

[5] 郜旭，赵庆杰，吴秀萍，等.γ-氨基丁酸类药物对急性脑梗死的保护作用及对兴奋性氨基酸的影响.中国急救医学，2004，24（9）：668

R749.940.5

A

1672-397X（2015）07-0080-03

朱先康（1955—），男，本科学历，主任中医师，从事儿科疾病的中医药诊疗研究。zhuxk09010@sina.com

2015-03-29

编辑：吴 宁

国家级重点学科南京中医药大学中医儿科学第二期开放研究课题（EZK2012019）