高乌头生物碱高乌甲素对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用研究

高稚淇谢 红陈 玲

（1.苏州大学附属第二医院麻醉科，江苏苏州215004；2.上海长海医院，上海200433）

高乌头生物碱高乌甲素对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用研究

高稚淇1谢 红1陈 玲2

（1.苏州大学附属第二医院麻醉科，江苏苏州215004；2.上海长海医院，上海200433）

目的：研究高乌甲素注射液预处理和后处理对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。方法：随机将48只雄性SD大鼠分为假手术组、模型组、高乌甲素预处理组和高乌甲素后处理组。除假手术组外其余各组大鼠采用可逆性冠脉左前降支结扎的方法复制心肌缺血/再灌注模型，给予大鼠心脏缺血30min再灌注120min；假手术组不缺血维持生命体征2h。高乌甲素预处理组于心肌缺血开始前15min静脉注射高乌甲素注射液（4mg/kg），高乌甲素后处理组于心肌缺血开始后10min静脉注射高乌甲素注射液（4mg/kg）。实验结束后用氯化三苯四氮唑染色法（TPT）测定心肌梗死范围，并测定血清中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果：模型组大鼠心肌出现缺血、梗死区，血清NO含量、SOD活性明显低于假手术组（P＜0.01），MDA含量明显高于假手术组（P＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，高乌甲素预处理组和后处理组大鼠心肌梗死范围显著减少（P＜0.05），NO含量、SOD活性显著增加（P＜0.01），MDA含量显著降低（P＜0.05）。结论：高乌甲素预处理和后处理可以减小心肌缺血/再灌注大鼠心肌梗死范围，其可能通过抗氧化机制对缺血再灌注心肌发挥保护作用。

高乌甲素 缺血再灌注损伤 心肌缺血 一氧化氮 丙二醛 超氧化物歧化酶 SD大鼠 实验研究

高乌头是毛茛科植物高乌头（Aconitum sinomontanum Nakai）的干燥根，是甘肃、青海、陕西太白地区、山西、湖北神农架地区、贵州、四川等地的民间草药，味辛、苦、温，有毒，具有祛风除湿、理气止痛、活血散瘀的功效，主要用于治疗风湿腰腿痛、胃痛、心悸、跌打损伤等。高乌头主要成分为高乌甲素等二萜生物碱，高乌甲素又名拉巴乌头碱（lappaconitine），临床常用其氢溴酸盐，具有强镇痛作用，还具有抗炎消肿、抗氧化、降温解热、抗心律失常、局部麻醉和免疫调节等作用[1-3]。还有研究报道高乌甲素可减轻颅脑创伤（TBI）大鼠的神经功能障碍和脑水肿程度，降低血清白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度，从而发挥对TBI大鼠的脑保护作用[4]，但高乌甲素是否具有活血散瘀功能国内尚未有研究报道。本实验基于在体大鼠心肌缺血再灌注模型，研究高乌甲素预处理及后处理对心肌缺血性损伤的保护作用，并初步探讨其作用机理。

1 实验材料

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号:SCXK（浙）2008-0033。

1.2 试剂与仪器 高乌甲素（采用氢溴酸高乌甲素注射液，批准文号:国药准字H20023150）；甲醛（西陇化工股份有限公司，批号:140218）；动物呼吸机（ALC-V9，上海奥尔科特生物科技有限公司）；智能恒温控制仪（JR-1，成都泰盟科技有限公司）；V24E多通道生理记录仪 （Philips公司，德国）；Anke LXJ-IIB离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子分析天平（BT125D，sartorius，德国）。

2 实验方法

2.1 分组、造模与给药 48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、高乌甲素预处理组、高乌甲素后处理组，每组12只。大鼠采用腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）进行麻醉，于右侧颈内静脉和颈内动脉置入充满肝素的导管，供补充液体、给药或监测动脉血压之用。气管切开后插入气管导管，连接动物呼吸机，行呼气末正压通气，吸入氧浓度30%，调节呼吸频率或潮气量，维持pH值7.35～7.45、PaCO225～40mmHg（1kPa=7.5mmHg）、PaO290～150mmHg，采用智能恒温控制仪维持大鼠体温在36～37℃。于第5肋间行左胸切开术，打开心包，采用6-0无损伤缝合线在左心耳下缘缝扎左冠状动脉前降支（LAD），缝线末端穿入自制圈套管，止血钳夹紧圈套管以阻断LAD血供，建立在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型[5]，当心外膜发绀苍白，心电图示一过性心律失常、ST段弓背向上抬高表示缺血模型成功，松开圈套管进行再灌注，可见心外膜重新充血。假手术组只穿线不结扎，高乌甲素预处理组于心肌缺血开始前15min经尾静脉注入高乌甲素注射液4mg/kg，高乌甲素后处理组于心肌缺血开始后10min经尾静脉注入高乌甲素注射液4mg/kg。

2.2 指标检测

2.2.1 血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量的测定 各组大鼠于再灌注末，采用颈总动脉插管取血5mL，室温或37℃恒温静置一段时间后，3000r/min离心10min得血清进行分装，-80℃贮存备用。血清中的NO含量采用硝酸还原酶法测定，操作步骤严格按照说明书进行；SOD采用化学比色法测定，测定波长为550nm；MDA采用硫代巴比妥酸盐法测定。

2.2.2 心肌梗死范围的测定 采用氯化硝基四氮唑（TPT）染色法[6]。心肌缺血再灌注结束后，再次阻断LAD，从颈内静脉注射5%伊文思蓝使左心室（LV）正常区域蓝染，并迅速取出心脏，分离出LV，并横断分割成5～6块2mm厚的组织。将LV中蓝染的正常组织与未染色的LV缺血区分离，并都放入0.5%TPT中，37℃水浴15min，10%甲醛过夜以固定组织。在解剖显微镜下将LV分成正常、缺血未梗死区和缺血梗死区三部分，并分别称重，计算缺血区心肌重量 （缺血未梗死区心肌重量＋梗死区心肌重量）占LV心肌重量的百分比，缺血区心肌重量占危险区心肌重量的百分比以及梗死区心肌重量占LV心肌重量的百分比。

2.3 统计学方法 采用SAS 8.2统计软件进行统计处理。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学差异。

3 实验结果

3.1 心肌梗死范围测定结果 各实验组左心室重无明显差异。与模型组比较，高乌甲素预处理组和高乌甲素后处理组的梗死区重、梗死区/左心室、梗死区/缺血区均显著降低（P＜0.05），说明高乌甲素预处理和高乌甲素后处理对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死范围比较（±s）

表1 各组大鼠心肌梗死范围比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05。

组别 动物数（只）缺血区重（g）左心室重（g）缺血区/左心室（%）假手术组 12梗死区重（g）0.5831±0.0102 —梗死区/左心室（%）—梗死区/缺血区（%）———模型组 12高乌甲素预处理组 12高乌甲素后处理组 12 0.5921±0.0204 0.2045±0.0192 0.5590±0.0701 0.1886±0.0276 0.0665±0.021*33.96±2.22 11.42±1.65*33.55±5.67*0.6000±0.0446 0.1789±0.04950.0678±0.033*32.56±2.12 11.22±1.35*33.25±5.34*0.1228±0.0174 36.28±2.56 19.22±2.61 50.77±6.05

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3.2 各组大鼠血清NO、SOD和MDA含量测定结果 与假手术组比较，模型组大鼠血清NO含量和SOD活性明显下降 （P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.05），提示造模成功。与模型组比较，高乌甲素预处理组和高乌甲素后处理组大鼠血清NO含量和SOD活性明显升高（P＜0.01），MDA含量显著降低（P＜0.05）。见表2。

4 讨论

缺血性心血管疾病是危害人类健康及生命的一类疾病，且具有发病率高和致死率高等特点，其致命后果就是由冠状动脉急性闭塞所致的急性心肌梗死及/或心脏性猝死，所以尽早恢复血流是减轻损伤的关键。经皮冠状动脉成形术 （percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）、冠状动脉内溶栓（thrombolysis）和冠脉搭桥手术等治疗手段的出台可以有效改善缺血，达到治疗目的。然而随之出现的心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）不仅不能使组织、器官功能恢复，反而引起心肌进一步功能障碍或者心肌细胞死亡，例如氧自由基堆积、细胞内钙超载、细胞凋亡等，已然成为心脏血管外科手术取效的主要障碍[7-8]。

一氧化氮（NO，即血管内皮舒张因子），在生物体内作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质的作用，同时又是一种效应分子，在体内具有广泛的生理作用，如松弛血管平滑肌。超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O2-·）保护细胞免受损伤。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，如醛基（丙二醛），测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[9-10]。

有研究表明高乌甲素以及其他几种从乌头地上部分分离得到的二萜类生物碱具有抗氧化、抗炎和抗酪氨酸酶活性的作用[11]，另外高乌甲素还可能通过阻滞电位依赖性的钠离子通道从而降低心肌的收缩力，提高心肌兴奋阈，导致心动过缓[12]，从而通过减少心肌氧耗发挥心肌细胞保护作用。本研究结果表明，与模型组比较，高乌甲素预处理及后处理组血清中NO含量、SOD活性显著提高，MDA含量显著下降，心肌梗死范围明显降低，由此可以推测高乌甲素可能通过抗氧化机制对缺血再灌注心肌发挥保护作用。因此，高乌甲素注射液预处理及后处理对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，可作为治疗缺血性心血管疾病的候选药物开展进一步研究。

表2 各组大鼠缺血再灌注后血清NO、SOD和MDA含量比较（±s）

表2 各组大鼠缺血再灌注后血清NO、SOD和MDA含量比较（±s）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 动物数（只）假手术组 12模型组 12高乌甲素预处理组 12高乌甲素预处理组 12 NO（μmol/L） SOD（U/mL）MDA（μmol/L）58.52±9.65 183.04±4.522.30±0.58 25.38±2.14##144.13±10.03##5.03±1.02##45.67±4.13**163.29±9.32**3.21±0.68*44.69±3.87**170.81±9.51**3.41±0.59*

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编辑：吴 宁

R282.710.5

A

1672-397X（2015）06-0079-03

高稚淇（1985—），女，硕士研究生，住院医师，研究方向：麻醉药物对心肌的保护作用。

谢红，博士，主任医师，硕士研究生导师。924831060@qq.com

2015-03-30