流动注射法与分光光度法测定海水中亚硝酸盐的含量

朱敬萍，梅光明，胡红美，李铁军，顾蓓乔，陈 瑜，尤炬炬

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

流动注射法与分光光度法测定海水中亚硝酸盐的含量

朱敬萍1,2，梅光明1,2，胡红美1,2，李铁军1,2，顾蓓乔1,2，陈 瑜1,2，尤炬炬1,2

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

采用流动注射法和分光光度法测定海水中的亚硝酸盐含量。通过实验条件的优化选择，建立了流动注射仪最佳测定方法。两种方法测定曲线线性范围均为0～0.05 mg/L，相关系数均大于0.999；流动注射法和分光光度法的方法检出限分别为0.002 6 mg/L和0.002 9 mg/L；在标准物质和实际水样测定中，二者测量结果基本一致，均具有较好的精密度和准确度；流动注射法在实际样品测定加标回收率为83.0%～101.6%，相对标准偏差为0.29%～4.57%。因流动注射分析法具有快速、省时、方便、基体干扰小，精密度和准确性好等优点，更适合批量样品的测定。

海水；亚硝酸盐；流动注射法；分光光度法

亚硝酸盐是一类无机化合物的总称，广泛存在于土壤、天然水和食品中，是一种极为常见的污染物。亚硝酸盐极不稳定，可以被氧化而生成硝酸盐，也极为容易被还原成氨，还可以与仲胺类反应生成亚硝胺类，这些物质均具有强烈的致癌作用[1-2]。海水中亚硝酸盐和硝酸盐主要来自大陆径流、沿岸排废和其他氮化合物的分解与排放[3-4]。亚硝酸盐含有丰富的氮肥，是藻类生长繁殖必需的营养物质。在海水养殖的水体中，如果亚硝酸盐含量低于0.1 mg/L，那么其对鱼类一般不会造成明显损害[5-6]；如果亚硝酸盐氮的含量达到0.1～0.5 mg/L，就会产生明显的中毒症状；当水体中亚硝酸盐的含量高于0.5 mg/L时，中毒症状会明显加剧，鱼类的某些器官会出现衰竭现象，严重时会导致其死亡[7-8]。因此海水中亚硝酸盐类含量是反应海水水质好坏的一个重要指标之一。为及时了解海洋生态环境状况和保持渔业养殖安全，有必要周期性地对某些特定水域的海水进行取样调查，以期了解水质状况，制定切实有效的治理与保护措施。目前亚硝酸盐含量的测定主要采用离子色谱法、极谱法、萘乙二胺分光光度法、催化光度法和荧光法[等[9-10]，前两种方法所需仪器价格昂贵，后三种方法普遍存在灵敏度低，操作繁琐，分析速度慢等缺点。近年来，运用流动注射分析的方法，测定海水中亚硝酸盐含量得到迅速的发展[11-12]，流动注射仪测定方法具有快速(可在1 h内完成50个样品测定)、灵敏度高、准确性好的优点。且仪器流路简单，试剂用量少，操作简便，对实际水样的测定效果良好。本研究对流动注射法测定海水中亚硝酸盐含量的测定条件进行了优化，并与紫外可见分光光度法与流动注射法进行分析对比。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AA3流动注射分析仪（德国SEAL Analytical公司）；图1为亚硝酸盐分析模块流路图。

图1 亚硝酸盐分析模块流路图Fig.1 The route map of nitrite

1.2 试剂

亚硝酸盐标准贮备溶液（100 mg/L，国家标准物质中心)；所用试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

磺胺溶液：(10 g/L)称取5 g磺胺，溶于350 mL盐酸溶液（1+6），用纯水稀释至500 mL，盛于棕色试剂瓶中，冰箱保存。

盐酸萘乙二胺溶液（NEDD）：1 g/L，称取0.5 g盐酸萘乙二胺，溶于500 mL纯水中，储存于棕色瓶中，冰箱保存。

显色剂：将100 mL优级纯磷酸加入约700 mL去离子水中，加入10.0 g磺胺，完全溶解后，再加入0.50 g NEDD和4mL的聚氧乙烯月桂醚溶液（Brij-35，30%），稀释至1000 mL，并混合均匀，储存于棕色瓶中，冷藏。

1.3 样品采集与预处理

于2011年7月和11月分别在舟山岱衢洋增殖放流海域、乐清湾泥蚶国家级水产种质资源保护区、洞头海域海水网箱养殖区特定水域以及从东极岛中间山海海域采集水样（表1）。用采水器采集各站位的水样，带回实验室经0.45 μm滤膜过滤后备用。应从速分析，如不能从速分析，需放置冷藏室保存。

表1 浙江沿岸海域水质监测采集点Tab.1 The list of water quality monitoring points in Zhejiang coastal waters

1.4 实验方法

1.4.1 分光光度法（萘乙二胺分光光度法）

1）方法原理：在酸性介质中亚硝酸盐与磺胺进行重氮化反应，其产物再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色偶氮染料，于543 nm波长处测定吸光度。方法检出限为0.003 mg/L。

2）绘制标准曲线：取6个50 mL容量瓶，分别移入0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL亚硝酸盐标准使用液（浓度为5.0mg/L），加纯水至标线，混匀，使标准系列浓度分别为：0.0，0.010，0.020，0.030，0.040，0.050mg/L。各加入1.0 mL磺胺溶液，混匀后放置5 min，再各加入1.0 mL盐酸萘乙二胺溶液混匀。放置15 min后，在543 nm波长、3 cm测定池下比色测定，以去离子水作参比，测定其吸光值。

1.4.2 连续流动分析法

1）方法原理：亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酰胺反应生成一个偶氮化合物，然后与萘乙二胺盐酸反应生成紫红色化合物在550 nm波长下检测。方法检出限为0.003 mg/L。

2）绘制标准曲线：根据样品浓度的高低配制亚硝酸盐标准系列。本研究中流动注射法采用与分光光度法一致的标准曲线范围（0～0.05 mg/L）。

3）仪器测定条件：连接试剂、纯水和试样。打开AA3流动注射分析仪和工作软件，键入实验参数：选通道、杯续杯数、样品数；进样/冲洗：1.5；平滑：16；基线校正：自动基线参比(%)10；运行延迟时间(min)：6.0。

4）启动AA3流动分析仪，加热池(37℃)，泵入纯水至基线稳定后，再泵入试剂到进样通道，达到试剂基线稳定；测定标准曲线，要先测一下标准浓度的最高点，最佳峰高为75%～95%之间，设定它的增益点。然后开始自动分析。

2 结果与讨论

2.1 条件试验的优化选择

对于流动注射法的条件优化，研究了各流路(试剂和载流)流速对峰高的影响,在流速为0.20～2.00mL/min范围内，经过反复试验，试剂流速为0.80 mL/min，载流流速为1.20 mL/min时，峰最高；因此，选择试剂流速为0.80 mL/min，载流流速为1.20 mL/min。对进样体积在0.2～1.2 mL时对峰高的影响进行反复试验，结果表明峰高随进样体积增大缓慢增加，为提高检测分析速度，试验采用进样体积0.5 mL。在上述实验条件下，适当的降低流速可以减少试剂消耗，并且可以反应完全，不用担心扩散和带过。在反应条件下，样品和试剂的流速可能会发生变化，试剂的浓度、室内和反应温度等会变化，但因为样品和标准经过同样的过程并达到稳态，所以它们的变化不会对结果准确性产生影响。

2.2 磷酸浓度的优化

显色剂中磷酸用量对峰高同样产生很大的影响，本实验在1 L显色剂中加入磷酸的体积分别为50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL、100 mL、110 mL，结果表明添加体积为50～100 mL，吸光度值趋上升趋势，100 mL时吸光度值达到最大，而磷酸加入量超过100 mL后，吸光度值下降很快，因此，选用100 mL为最佳加入量。如果出现灵敏度低或线性不好，要通过实验来调整试剂的浓度。确保良好的重现性和低检出限，保证反应环境的小变化不会影响结果。

2.3 方法的线性范围和检出限

用流动注射法和分光光度法制作亚硝酸盐测定的标准曲线分别见图2和图3所示。结果表明：在上述已优化好的测量条件下，流动注射法和分光光度法在0～0.05 mg/L测定范围内，吸光度值与浓度均呈良好的线性关系，线性回归方程分别为y=9. 1146E-007和y=10.26C-0.0019(C、E单位为mg/L，y为吸光值），相关素数R均大于0.999，能满足分析检测要求。用统计测量法对空白溶液连续测定15次，得出流动注射法和分光光度法的方法检出限分别为0.0026 mg/L和0.0029 mg/L

图2 分光光度法标准曲线Fig.2 Standard curve of spectrophotometric analysis

图3 流动注射法标准曲线Fig.3 Standard curve of flow injection analysis

2.4 精密度和准确度

以标准物质编号为GSBZ 200619和GSBZ 200624样品进行平行各6次测定，检测结果见表2。

表2 标准物质参比值Tab.2 The standard material's reference value

从表中可知，通过优化好的测量条件，经AA3流动注射分析仪和分光光度法测定亚硝酸盐标准物质，均在标准值范围内。流动注射法测得的相对标准偏差在0.044%～0.691%之间，分光光度法的相对标准偏差在0.278%～1.119%之间，说明流动注射法与分光光度法均具有较好的精密度和准确度，符合分析要求。

2.5 海水样品检测结果及加标回收率实验

本研究对舟山岱衢洋、乐清湾、洞头、中间山海附近海域采集样品，将水样过滤后进行分析，同时采用流动注射法和分光光度法进行测定，并采用标准加入法，在样品中添加标准溶液后用流动注射法平行测定6次，进行加标回收试验，分析结果见表3。

表3 样品分析结果Tab.3 The results of the samples

由上表可知，流动注射分析仪测定结果与分光光度法手动测量结果基本一致，样品的加标回收率在83.0%～101.6%之间，相对标准偏差在0.29%～4.57%，具有较好的准确度。相对标准偏差均小于5.0%，符合《GB17378.4-2007海洋监测规范》中要求RSD≤10%的规定要求[13]。结果表明流动注射法有较好的精密度和准确度，符合国标的检测要求。

3 小结

本研究采用分光光度法和流动注射法测定海水中的亚硝酸盐含量，对流动注射法的试验条件选择进行优化，建立了最佳测定方法。在标准物质和实际水样测定中，二者测量结果基本一致，均具有较好的精密度和准确度。因流动注射分析法具有快速、省时、方便、基体干扰小，精密度和准确性好等优点，更适合批量样品的测定。参考文献：

[1]董 彦，吕春玲．基于亚硝化反应分光光度法测定亚硝酸根[J]．光谱学与光谱分析,2001,21(5):710-712.

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[11]李建民,刘胜玉,刘 珩.流动注射分析仪及总氮的流动注射分析法简介[J].人民珠江,2006(6):65-67.

[12]王 蕊,魏书华,史泽溪,等．流动注射分析的发展及应用[J].河北工业科技,2009,26(5):379-383.

[13]GB17378.4-2007海洋监测规范[S]．

Determination of Nitrite in Seawater by the Flow Injection Method

ZHU Jing-ping1,2,MEI Guang-ming1,2,HU Hong-mei1,2,et al
(1.Institute of Marine and Fisheries of Zhejiang Ocean University,Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021;2.Key Lab of Mariculture and Enhancement of Zhejiang province,Zhoushan 316021,China)

The present study introduced the experiment method of determining nitrite in seawater by flow injection and spectrophotometric method.Through the optimization of the experimental conditions,the optimum flow injection method was given.The linear range of determination standard curve for the two methods was 0-0.05 mg/L,with the correlation coefficients all above 0.999.The detection limits were 0.002 6 mg/L and 0.002 9 mg/L, respectively for flow injection method and spectrophotometric method.In determinations of the standard substances and actual samples,the two methods gave the consistent measurement results and both had good precision and accuracy.The recoveries of spiking samples in flow injection analysis were 83.0%-101.6%,and the relative standard deviations were 0.29%-4.57%.With the advantages of fast,time-saving,convenient,little interference and better precision and accuracy,the flow injection analysis method is more suitable for assaying mass samples.

sea water;nitrite;flow injection method;spectrophotometric method

X832

A

1008－830X(2015)01－0050－04

2014-10-30

浙江省重大科技成果专项计划项目（2012C13005）；浙江省科技计划项目（2013F10065）

朱敬萍（1960-），女，山东滕州人，高级工程师，研究方向：水域环境及食品安全分析.E-mail:ZJP669888@163.com

顾蓓乔（1963-），男，上海市人，研究方向：水域环境及食品加工.E-mail:gbq@zjou.edu.cn