响应面法优化杜香多糖提取工艺

张乔会，逄锦慧，杨 喆，王建中

北京林业大学 北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083

杜香(Ledum palustre L.)为杜鹃花科杜香属的常绿灌木［1］，是我国东北、内蒙古大兴安岭林区的主要森林组成树种，其分布面积约占大兴安岭林地面积的70%［2］。大兴安岭杜香干叶年生产量达536925 t/a，小兴安岭杜香的蕴藏量可达8776.7 t/hm2·a，其中允收量以鲜重计为1843.2 t/hm2·a［3］。杜香枝叶含有多种挥发性成分［4］、黄酮类成分、香豆素类成分等。具有抗菌消炎、透皮吸收、驱虫、抗辐射等作用［5-7］。可以制作驱虫剂、保健品、日用品［8］、药品等，在食品、保健品、化妆品及医药等领域具有广泛的应用前景。

杜香多糖的提取目前鲜见报道，但作为天然的植物多糖，具有广谱化学结构和生物功能。多糖的提取可采用水提取法、中性盐溶液提取法、碱提取法、蛋白酶水解提取法等［9］。其中水作溶剂是提取植物中多糖的常用方法。植物源多糖常具有提高人体免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗凝血、抗炎等生理活性［10-12］，还有抑制脂类氧化、稳定蛋白等作用［13，14］。本文以杜香为原料采用水提醇沉法提取多糖，利用红外和紫外光谱分析多糖特征基团及含量，并用响应面法对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

HHS4-型恒温水浴锅:上海浦东跃新科学仪器厂;KQ-500E 型超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;QI-901 涡旋混合器:海门市其林贝尔仪器制造有限公司;台式离心机:上海安亭科学仪器厂;RE-5203 旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;METTLER TOLEDO-电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;冷冻干燥机FD-1:北京德天佑科技发展有限公司;T6 紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;Tensor27 型FT-IR 红外光谱仪:德国Bruker 公司。

1.2 试剂及材料

无水乙醇、去离子水、石油醚、浓硫酸、蒽酮、葡萄糖等，所有试剂均为分析纯。杜香(由内蒙古金河林业局2013 年7 月中旬采集提供，由北京林业大学植物专家坚定为杜香)。

1.3 试验方法

1.3.1 试样的制备

将杜香枝叶切分成2～3 cm 的小段后于40 ℃烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎，过20、40、60、80、100 目筛，存于室内阴凉干燥处备用。

1.3.2 杜香多糖提取工艺

采用水提醇沉法。准确称取一定量的杜香枝叶粉，按一定比例加入去离子水，放入恒温水浴震荡箱中震荡一定时间，离心分离液体和固体粉末，向上清液体中加入酒精至浓度为85%，放置于4 ℃冰箱中静置1 h，分离固液两相，固体为粗多糖。将上一步得到的样品加入一定量的石油醚处理一定时间进行脱脂，接着将上一步得到的固相溶解于一定量的去离子水中，加入酒精至浓度为85%，放置于4 ℃冰箱中静置1 h，然后分离固液两相，重复上述操作4次，冷冻干燥，便可得到杜香多糖成品。

1.3.3 杜香多糖定性检测

在4000～400 cm-1波长范围内对水提醇沉得到的杜香多糖进行红外检测，测定分辨率为2 cm-1。

1.3.4 得率计算

按以下公式计算提取得率:

式中P-得率;m-提取得到的杜香多糖的干重;W-杜香枝叶粉末的重量。

1.3.5 粗提物中多糖含量测定

杜香多糖粗提物多糖含量的测定采用蒽酮硫酸法，并以葡萄为参照作标准曲线。

1.3.5.1 标准曲线测定

精密称取105 ℃下干燥恒重的分析纯葡萄糖0.05 g，置于小烧杯中，加去离子水溶解并转移至1000 mL 容量瓶中，摇匀，配制成浓度为0.05 mg/mL 葡萄糖标准溶液。准确移取浓度为0.05 mg/mL葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 于10 mL 比色管中，加蒸馏水补足至1 mL。在冰水浴中加入0.1%蒽酮硫酸溶液4 mL，摇匀。置于沸水浴中加热15 min 后取出，自来水冷却至室温并放置10 min，以蒸馏水代替样液作空白，在最580 nm 处读取吸光度。以葡萄糖含量为纵坐标、吸光度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.5.2 杜香多糖含量的测定

准确称取提取的杜香多糖0.03 g，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.3 mg/mL 的杜香多糖贮备液。将杜香多糖贮备液稀释10 倍后，取1 mL 按1.3.5.1 方法测定杜香多糖贮备液的吸光度，根据标准曲线方程求出此杜香多糖贮备液中含量，从而计算出杜香多糖粗提物中多糖的含量。

1.3.6 杜香多糖提取的单因素试验设计

分别以不同的提取温度、时间、物料粒度及液料比为单因素，考察各因素对杜香多糖提取得率的影响。

1.3.6.1 物料粒度

设定料液比1∶20，提取温度60 ℃，提取时间2 h，考察物料粒度分别为20、40、60、80、100 目时对多糖提取得率的影响。

1.3.6.2 料液比

设定物料粒度40 目，提取温度60 ℃，提取时间2 h，考察料液比分别为1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1∶30、1∶35(m/v)时对多糖提取得率的影响。

1.3.6.3 提取时间

设定物料粒度40 目，料液比1∶20，提取温度60℃，考察提取时间分别为1、2、3、4、5 h 时对多糖提取得率的影响。

1.3.6.4 提取温度

设定物料粒度40 目，料液比1∶20，提取时间2 h，考察提取温度分别为20、40、60、80、100 ℃时对多糖提取得率的影响。

1.3.7 杜香多糖提取工艺的试验设计

在单因素试验的基础上，运用Design expert 7.1软件程序，根据Box-Behnken 中心组合实验设计原理［5，15］，采用四因素三水平的响应面分析法，以提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、物料粒度(D)为自变量，以杜香多糖的提取率为响应值，通过响应曲面分析(response surface analysis，RSA)对提取条件进行优化。

表1 响应面试验因素水平设计表Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 结果与分析

2.1 杜香多糖红外检测结果

杜香多糖红外谱图在3389、1156-1024、1024、2889 cm-1的尖峰以及1567～1370、1648、1648、903 cm-1等处具有强弱不同的吸收峰。在3389 cm-1和1156～1024 cm-1的峰分别为O-H 和C-O 的伸缩振动，1024 cm-1的较强吸收也说明了杜香多糖中可能有葡萄糖结构，2889 cm-1的尖峰以及1567～1370 cm-1的不太尖的峰分别为C-H 的伸缩振动和变角振动，1648 cm-1处出现吸收峰，推测该峰为醛基中C=O 的伸缩振动引起的，谱图在1648 cm-1波数处还出现一个较强的吸收峰，说明杜香多糖中可能有酰氨取代基，谱图在903 cm-1波数处还出现吸收峰，说明杜香多糖可能含有β-型糖苷键。总之，杜香水提醇沉物具有多糖的一般吸收峰，证明杜香水提醇沉物为杜香多糖。

2.2 杜香多糖粗提物中多糖含量测定结果

在葡萄糖含量为0.000～0.100 mg/mL 的范围内，葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。经线性回归，标准曲线方程为y=9.790x-0.002，回归系数R2=0.9955。测得杜香粗提物的吸光值为0.272，从而计算出杜香多糖粗提物中多糖的含量为92.6%。

2.3 杜香多糖提取单因素实验结果

从图1-A 可以看出，在提取时间、提取温度、料液比一定的时候，材料粒度的大小对杜香多糖的提取得率的影响呈正相关。物料越细，提取得率越大，且随着物料目数的增大，杜香多糖的提取得率以稳定的趋势上升。但由于将物料粉碎过细会影响下一步分离，且能耗大不环保，故只考虑至100 目。

从图1-B 看出，料液比从1∶10 增加到1∶20时，杜香多糖提取得率稳步上升，可能是因为随着料液比增大，目的提取物会更易溶于提取溶剂中;料液比在1∶20 至1∶30 之间时，提取得率增加变缓，可能是因为一定比例的溶剂已经将有效成分大部分溶出;料液比在1∶30 至1∶35 之间时，提取得率受到的影响不大，可能是由于足够的溶剂已经将多糖全部溶解，再加大料液比会使杂质更多溶出，从而造成多糖提取得率下降。因此选择1∶30 作为优选料液比。

图1 物料粒度(A)、料液比(B)、时间(C)、温度(D)对杜香多糖提取得率的影响Fig.1 Effects of particle size of Ledum (A)，solid:liquid ratio (B)，time(C)，temperature(D)on extraction yield of Ledum polysaccharide

从图1-C 可以看出，提取时长4 h 以内，随着提取时间的增加，杜香多糖的提取得率逐渐增大，但提取2 h 后提取得率增加逐渐减缓。提取4 h 后，提取得率随时间基本没有变化，可能是物料中能溶解的多糖已经基本溶出。因此确定优选提取时间为4 h。

从图1-D 可以看出，温度的高低对杜香多糖的提取有较大的影响。随着温度的升高，提取得率增大，当温度达到80 ℃时提取得率最大，之后提取得率随温度的增加基本没有变化。所以确定优选提取温度为80 ℃。

2.4 响应面模型的建立及结果

2.4.1 响应面模型回归分析

以A(提取温度)、B(提取时间)、C(料液比)、D(物料粒度)为变量，以杜香多糖的提取得率为响应值，按响应面软件Design expert 7.1 提供设计的组合进行试验，得到结果见表2。

表2 响应面分析的试验结果Table 2 Program and experimental results of RSA

采用Design expert 7.1 软件程序对试验数据进行回归分析，得出杜香多糖提取得率的回归方程如下:Y=0.38 +1.925E-003 ×A +8.483E-003 ×B +4.317E-003 × C+0.10 × D-5.000E-005 × AB -5.150E-003 ×AC +6.575E-003 ×AD +3.300E-003×BC+7.900E-003 ×BD +5.500E-004 ×CD-0.017×A2-1.912E-003 ×B2-1.038E-003 ×C2-0.089 ×D2。

其决定系数R2=0.9952，说明回归方程适用于提取杜香多糖的理论预测值。对回归方程做显著性检验与方差分析，结果见表3。

表3 二次响应面回归模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

2.4.2 响应面与等高线

根据回归方程，作出响应面和等高线图，考察拟合响应曲面的形状，分提取温度、提取时间、料液比和物料粒度对杜香多糖提取得率的影响，如图2～7所示。等高线的形状可以反映出交互相的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反［16］。由二次响应面回归模型方差分析可知，物料粒度对杜香多糖提取得率的影响最大，提取温度、液料比、提取时间的影响相对小一些，具体为:物料粒度(D)＞提取温度(A)＞液料比(B)＞提取时间(C)。即达到一定的料液比和提取间后，料液比和提取时间对提取得率的影响十分微小。

图2 Y=f (A，B)的响应面与等高线Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y=f (A，B)

图3 Y=f (A，C)的响应面与等高线Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y=f (A，C)

图4 Y=f (A，D)的响应面与等高线Fig.5 Response surface plot and contour plot of Y=f (A，D)

图5 Y=f (B，C)的响应面与等高线Fig.5 Response surface plot and contour plot of Y=f (B，C)

图6 Y=f (B，D)的响应面与等高线Fig.6 Response surface plot and contour plot of Y=f (B，D)

图7 Y=f (C，D)的响应面与等高线Fig.7 Response surface plot and contour plot of Y=f (C，D)

2.4.3 优化提取工艺条件的确定

为进一步确定最佳点，利用Design expert7.1 软件程序对工艺条件进行优化，可得杜香多糖提取得率的最佳方案为:提取温度为80.43 ℃，提取时间为6 h，液料比为35∶1(mL/g)，物料粒度为84.55 目。在此工艺条件下，软件程序对杜香多糖提取得率的预测值为4.26%。为了实际的操作方便，将杜香多糖的提取工艺参数修正为:提取温度为80 ℃，提取时间为6 h，料液比为1∶35(m/v)，物料粒度为80目，在此条件下实际测得的平均提取得率为4.19%，与理论预测值相比相对误差约为1.64%。因此采用修正后的方法得到的提取参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

以杜香枝叶粉末为原料，以水为溶剂提取杜香多糖，主要受物料粒度和提取温度的影响。提取时间和料液比达到一定程度后对提取得率的影响不大。利用响应面法对杜香多糖的提取工艺进行了优化。得到的水提杜香多糖的优化工艺条件为提取温度为80 ℃，提取时间为6 h，料液比为1∶35(m/v)，物料粒度为80 目，在此条件下杜香多糖的提取得率可达4.19%。

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