补肾固筋方对SD 大鼠膝骨关节炎IL-1、iNOS 分泌的抑制作用

张 冲 ，渠玲玲，王恒树，张春利，李双成，黄 芸*，吴中秋

1河北省中医院骨三科，石家庄 050000;2 河北医科大学;3河北医科大学第二医院，石家庄 050011;4 河北中医学院，石家庄 050017

膝骨性关节炎(knee osteoarthritis，KOA)软骨下骨萎缩象牙样硬化，关节囊纤维变性为病理特征的慢性退行性病变。病变关节肿胀轻度压痛，伴滑膜炎时可见关节内积液，严重者有不同程度的肌萎缩或关节畸形。《素问·痹论》:风寒湿三气杂至，合而为痹［1］。临床多用非甾体类药物或胫骨高位截骨、人工关节置换术，患者难以接受［2］。近年有学者研究发现熟地、千年健等中药治疗KOA 疗效确切［3］。本实验拟阐明补肾固筋方对IL-1、iNOS 的调节与KOA 的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SD 大鼠44 只，15 月龄，健康，雄性，饲养到28月龄体重350～370 g，根据人鼠龄换算此月龄大鼠与中老年人相近。河北医科大学实验动物中心提供［动物质量合格证号:SYXK(沪)2013-0231］。

1.2 药物

补肾固筋方组:熟地15 g、补骨脂12 g、枸杞子10 g、巴戟天10 g、牛膝12 g、丹参10 g、木瓜8 g、鸡血藤10 g，根据进食情况、精神，喜暖恶寒，活动等中医辨证加减治疗，风寒湿痹加防风、羌活;风湿热痹加茯苓、石膏;瘀血闭阻加红花、地龙;肝肾亏虚偏阴虚加山茱萸、牛膝;偏阳虚加附子、肉桂;取汁300 mL。药液浓缩成6 g/mL;美洛昔康胶囊，7.5 mg，四川宝光药业，国准字:H20010209，批次:120502770265，配成0.5 mg/mL 溶液。

1.3 主要试剂及仪器

SD 大鼠IL-1、iNOS ELISA 试剂盒(规格:96T，Abcam US，批号:AB22031)，显色剂显色(DAB 等)，采用酶联免疫吸附剂测定法检测血清软骨及滑液标记物;酶联免疫检测仪(ELX-800 US)、96 孔板(Costar US);Retsch 德国干燥箱(型号:TG100，Germany RETSCH Company);恒温水箱(DDIL-5 型，上海安亭科学仪器厂);石蜡切片机(u-641 型，美国贝克曼公司);光学显微镜照相系统(BH-5 型日本Olympus 公司);全自动图像分析系统(MCS-7200，德国Leica);723 分光光度计(ELX8086 型，美国宝特公司);数码X 光机(DR-500，美国GE 公司)。

2 实验方法

2.1 模型制备

实验动物随机分为正常组、模型组(生理盐水组)、美洛昔康组及补肾固筋方组，每组11 只，除正常组外均采用改良Hulth 造模［4］。10%水合氯醛，0.3～0.4 mL/100g 腹腔注射麻醉，先注射总量的2/3 随后根据情况适当追加10%水合氯醛0.2～0.5 mL 直至麻醉成功。右后肢膝关节外侧纵切口长约5 cm，逐层切开、分离，探查关节腔无原发病变后，完整切除内侧半月板、ACL(Anterior Cruciate Ligament)及MCL(Medial Collateral Ligament)，造成负重力线内移及膝关节不稳。术侧肢体不固定，术后肌注青霉素160 万IU/(kg·d)，连续8 d，每隔1 d 观察创口愈合情况，预防感染。术后第7 d 开始强迫大鼠奔跑(1.5 h/d)。当胫股关节面正常外翻10°变为内翻，X 射线片显示下肢力线改变明显跛行明显，表示造模成功。造模3 周软骨出现改变，7 周后进入平台期，11 周出现典型的晚期OA 病理改变。造模成功率为86%。

2.2 干预方法

造模3 周后开始干预，人与动物的体表面积计算法换算:SD 大鼠每日药量(2.5 kg)=成人(60 kg)每日药量×0.04 ×2.5 ×1/3，正常组、模型组鼻饲胃管注射10 mL 生理盐水，2 次/d;美洛昔康每日药量约为4 mg/kg，补肾固筋方每日药量为43 g/kg，每天两次鼻饲胃管注射。连续干预12 周。

2.3 检测指标

2.3.1 步态观察

David Coderre 步态分级［5］评价。0 级:正常行走，行走时间＞5 min;Ⅰ级:轻微跛行，行走时间3～5 min;Ⅱ级:中度跛行，行走时间＜3min。

2.3.2 形态学观察及IL-1、iNOS 检测

颈椎脱臼法处死后1 mL 生理盐水灌洗关节腔，取胫骨内侧软骨面，肉眼观察SD 大鼠膝关节软骨面情况，切取膝关节前方部分滑膜组织和股骨内髁关节软骨及软骨下骨，剪成约0.5 cm ×0.6 cm ×0.3 cm 组织块，病理切片(5 μm)，HE 染色，形态学观察关节软骨的层次、软骨细胞及软骨下骨变化;空腹取血5 mL，5000 rpm 离心10 min 分离血清，-60℃冰箱保存。

2.4 统计学处理

3 实验结果

3.1 一般状态比较

正常组软骨蓝白色，色泽透明，触之较硬，关节液量少;模型组滑膜肿胀，关节边缘与滑膜有少许纤维性粘连凹凸不平;两个给药组关节软骨呈白色，欠光滑，滑膜轻度增生，关节液较正常组稍多，滑膜炎性表现较模型组轻。

3.2 X 射线比较

颈椎脱臼法处死动物前拍摄SD 大鼠膝关节正位DR(Digital Radiography)片，David T［6］法分级:0度:未见异常;Ⅰ度:可疑;Ⅱ度:肯定;Ⅲ度:明显硬化。Lane-Sandhu X 线评分［7］。正常组大鼠膝关节内外侧间隙均匀一致，关节面平整，边缘整齐规则无骨赘，关节内无游离体;模型组膝关节内侧间隙变窄外侧间隙增大，骨囊变、骨赘形成;美洛昔康组膝关节内侧间隙介于模型组和中药组之间，有轻微骨赘形成;补肾固筋方组膝关节内侧间隙狭窄不明显，未见明显骨赘形成。

图1 正常组(A)、模型组(B)、美洛昔康组(C)及补肾固筋方组(D)的膝关节正位DR 片Fig.1 Knee anteroposterior X-rays of normal group (A)，model group (B)，meloxicam group (C)and BSGJP group (D)

表1 造模成功后6、12 周Lane-Sandhu X 射线评分(Mean±SD，n=11)Table 1 Lane-Sandhu X scores at 6，12 weeks after the modeling (Mean±SD，n=11)

3.3 形态学比较

如图2 所示，正常组膝关节软骨蓝白色透明，表面光滑，触之适中，关节液量正常;模型组滑膜肿胀，软骨表面浑浊淡黄色不光滑触之较硬，关节边缘与滑膜有少许纤维性粘连，镜下软骨细胞排列不完整呈深层簇聚;美洛昔康药和补肾固筋方组关节软骨白色光滑，滑膜轻度增生，关节液较模型组少，两组滑膜炎性表现较模型组轻。电镜下模型组较美洛昔康组软骨细胞排列欠规整、簇状增生明显，补肾固筋方组较正常组软骨细胞完整且排列整齐。

图2 正常组(A)、模型组(B)、美洛昔康组(C)及补肾固筋方组(D)大鼠膝关节胫骨关节内侧关节软骨面情况(HE，×40)Fig.2 Knee medial tibial articular cartilage of rats from normal group (A)，model group (B)，meloxicam group (C)and BSGLP group (D)(HE，×40)

3.4 IL-1、iNOS 比较

与正常组比较，模型组血清及关节液IL-1、iNOS含量升高(P＜0.01)。两个给药组与模型组比较血清及关节液IL-1、iNOS 含量降低(P＜0.01)，两个给药组之间比较差异无统计学意义(P ＞0.05)(表2)。

表2 血清及关节液IL-1、iNOS 含量比较(Mean±SD)Table 2 Concentration of interleukin-1，inducible nitric oxide synthase content of serum and synovial fluid (Mean±SD)

4 讨论

Evan G 和Little wood T［8］在1983 年首先报道了在类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)和骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)中都可检测到IL-1的存在;IL-1 可诱发慢性滑膜炎，软骨基质降解产物的刺激也可引起滑膜的继发炎症［9］，促进软骨细胞分泌前列腺素(PGE2Prostaglandins 2)［10］，刺激骨吸收及成骨细胞增生钙化，软骨下骨增厚骨赘生成［11］。OA 软骨免疫组化染色的基质及细胞中IL-1、iNOS 及其受体均呈现阳性反应，强度与范围和OA 严重程度相对应［12］;IL-1、iNOS 促进多形核细胞，刺激滑膜细胞的PGE2分泌，增加骨软骨的破坏，IL-1、iNOS 促进滑膜成纤维细胞样细胞增殖，增强RNA 的表达功能，最终滑膜组织纤维性变性，IL-1、iNOS 相互协同，加快了膝关节软骨基质的破坏［13］。

治则补益肝肾，强筋健骨，熟地、补骨脂为君药，熟地性微温、味甘，滋阴养血，补骨脂是补肾壮阳益精填髓之要药，熟地、补骨脂和枸杞子配伍改善微循环与血液流变学，降低骨内压，缓解骨和骨髓血流动力学及其引起的代谢异常［14］，更有利于促进软骨修复;臣药巴戟天、川牛膝和鸡血藤改善软骨细胞功能，促进软骨修复，刺激软骨破坏区产生大量幼稚软骨［15］，减少或阻断因软骨片丢失刺激滑膜分泌［16，17］;木瓜、丹参活血化瘀药可以促进关节内外的血液循环，改善静脉瘀滞状态，降低骨内压［18］。研究中观察到治疗12 周后羊关节积液明显减少，X线片示骨端变性，软骨下骨质萎缩，狭窄的间隙明显增宽，中药组滑膜组织TNF-α、iNOS 含量降低，OA滑膜进一步变性对滑膜增殖及RNA 的表达有促进作用;对照组则相反。补肾固筋方减少TNF-α、iNOS的分泌对软骨和滑膜的侵害，抑制滑膜炎性改变，同时滑膜渗透作用于软骨细胞增强软骨细胞的代偿能力，修复并延缓软骨退变、促进软骨修复。

1 The Administration of TCM (国家中医药管理局).TCM Syndrome Diagnostic Efficacy of the Standard (中医病证诊断疗效标准).Nanjing:Nanjing University Press，1999.48-55.

2 Fitzgerald GK，White DK，Piva SR.Associations for change in physical and psychological factors and treatment response following exercise in knee osteoarthritis:an exploratory study.Arthritis Care Res，2012，64:1673-1680.

3 Cui XN (崔向宁)，Li YB (李玉波)，Li Y(李妍)，et al.The influence of brain tumor necrosis factor-α，nuclear transcription factor-KB and aquaporin-4 expression in rats with cerebral hemorrhage.Chin Integr Med (中国中西医结合杂志)，2015，2:513-515.

4 Hulth A，Lindberg L，Telhag H.Experimental osteoarthritis in rabbits.J Acta Orthop Scand，1970，41:522-530.

5 Coderre D，Le Marechal H，Ekindjian OG，et al.Nitric oxide modifies glycolytic pathways in cultured human’s，iNOS viocytes.Cell Biol，2008，2:285-286.

6 David T，Atkins CM，Allen MT，et al.Inhibition of nitric oxide synthesis impairs two different forms of learning.Neuworeport，2012，3:567-570.

7 Bradbury N，Hutchinson J，Hahn D，et al.Clavicular nonunion.31/32 healed after plate fixation and bone grafting.Acta Orthopaedica Scandinavica，1996，67:367-370.

8 Wood H，Geroganas C，Pagliari LI，et al.Bcl-2 expression in syvial fibroblast is essential for maintaining mitochondrial homeostasis and cell viability.J Immunol，2000，164:5227-5235.

9 Parmelee PA，Harralson TL，McPherron JA，et al.The structure of affective symptomatology in older adults with osteoarthritis.Int J Geriatr Psychiatry，2013，28:393-401.

10 Venkataramanan V，Gignac MA，Dunbar M，et al.The importance of perceived helplessness and emotional health in understanding the relationship among pain，function，and satisfaction following revision knee replacement surgery.Osteoarthritis Cartilage，2013，21:911-917.

11 Racine J，Aaron RK.Pathogenesis and epidemiology of osteoarthritis.R I Med J，2013，96(3):19-22.

12 Li X (李旭)，Wang HL(王海立)，Zhu L(朱炼)，et al.The effection of long-term impact on bilateral after complete resection of unilateral line patellar fragility fractures.J Orthopaedic Trauma(中华创伤骨科杂志)，2013，11:928-931.

13 Wang HL，Zhu L.The effection of long-term impact on bilateral after complete resection of unilateral line patellar fragility fractures.J Orthopaedic Trauma，2013，11:928-931.

14 Qu W(曲伟)，Wang MJ(王孟君)，Yu HY(于海燕)，et al.Study on the antioxidant activity of Maojian tea polysaccha-rides and its conjugate.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2015，27:210-213.

15 Li Z(李智)，Yu JY(于金英)，Jiang Y(蒋瑶)，et al.Optimization of matrix recipe of Bitongting cataplasm by Box-Behnken design.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2015，27:226-231.

16 Ji WF (季卫锋).Experimental study of osteoarthritis prevention act rat knee.J Chin Orthopedics (中国骨伤)，2012，28:246-250.

17 Xu F(许峰)，Zhang GH(章光华)，Li HH(李欢华).Juan hunchback pill treatment of postmenopausal osteoporosis with 37 cases.J Tradit Chin Med(中医杂志)，2013，12:117-118.

18 Li L(李丽)，Qiu QY(邱全瑛)，Wu WJ (吴王君)，et al.The experimental research on particle immunomodulatory effects in DTH Mice circulation Juanbi painless granules.J Beijing Univ Tradit Chin Med (北京中医药大学学报)，2013，22(5):67-70.