RP-HPLC 法同时测定颐脑解郁颗粒中栀子苷和五味子醇甲

赵卫云 ，孙耀志，高 松，杨 玲，王瑞娜，冯德文

1河南中医学院药学院;2 河南省宛西制药股份有限公司研发部，郑州 450000

颐脑解郁颗粒来源于北京中医药大学第三附属医院唐启盛教授的验方，本方由栀子、五味子、郁金、刺五加四味中药组成。具有益肾调气、解郁安神的作用，在临床上常用于肾精不足，肝气郁滞所致抑郁症者。方中栀子对中枢神经系统具有镇痛镇静的作用［1］，环烯醚萜类化合物是栀子中的主要活性成分，其所含的栀子苷可作为本颗粒质量控制的指标成分。五味子中含有的多种木脂素成分被认为是五味子中最主要的药理活性成分，其所含的五味子醇甲具有广泛的中枢抑制作用和神经保护作用［2，3］。采用HPLC 法单独测定栀子苷、五味子醇甲的文献已有报道［4-8］，但在同一色谱条件下实现这2 种组分同时测定的方法尚未见报道。本实验采用梯度洗脱，可一次进样同时检测上述2 种成分，检测效率高，且精密度、稳定性等方法学考察均符合要求，可为颐脑解郁颗粒质量标准的制定提供可靠的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AL104 电子天平和MS105 电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

栀子苷对照品(批号:0749-200007)、五味子醇甲对照品(批号:110857-201211)，均购自中国食品药品检定研究院;颐脑解郁颗粒(批号:20130301、20130401、20130501)为宛西制药研发部自制;甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Eclipse XDB-C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～12 min，30% A;12～20 min，30%～60% A;20～40 min 60%A)，体积流量1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长为238 nm(0～20 min)，250 nm(20～40 min)。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取栀子苷与五味子醇甲对照品适量，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀配置1 mL 含栀子苷0.1432 mg、五味子醇甲0.0513 mg 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

按颐脑解郁颗粒的处方比例和制备工艺，分别制备缺栀子和缺五味子的阴性制剂，按2.2.2 项供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，按2.1 项下色谱条件进行测定。阴性对照色谱图中，在与供试品及对照品色谱图中相应的保留时间处无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。见图1。

图1 混合对照品(A)、颐脑解郁颗粒供试品(B)、缺五味子阴性样品(C)及缺栀子阴性样品(D)的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)，Yinao Jieyu Granules (B)，negative sample without Schisandrae Chinensis Fructus (C)and negative sample without Gardeniae Fructus (D)

2.3.2 线性关系考察

分别精密吸取2.2.1 项下混合对照品溶液2、4、6、8、12、16、20 μL，依次进样，按照2.1 项下色谱条件测定峰面积。以对照品的进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程:栀子苷Y=1469.71X+74.39;相关系数r=0.9997。表明栀子苷的含量在0.2864～2.8640 μg 之间，进样量与峰面积呈良好的线性关系。五味子醇甲Y=2077.52X +7.21;相关系数r=0.9999。表明五味子醇甲的含量在0.1062～1.0620 μg 之间，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6 次，栀子苷、五味子醇甲峰面积RSD分别为1.16%、1.35%。

2.3.4 稳定性试验

取同一供试品溶液，按2.1 项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h 进样10 μL，测定峰面积，栀子苷、五味子醇甲峰面积RSD 分别为1.64%、1.82%。表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.3.5 重复性试验

取同一批样品，按2.2.2 项供试品溶液的制备方法平行制备6 份供试品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，测定栀子苷、五味子醇甲的峰面积，计算得栀子苷的平均质量分数为8.50 mg/g，RSD 为1.36%，五味子醇甲的平均质量分数为2.84 mg/g，RSD 为1.62%。表明本实验方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

称取已知含有量的样品0.5 g，平行6 份，精密称定，分别精密加入栀子苷和五味子醇甲混合对照品溶液(含栀子苷0.4242 mg/mL 和五味子醇甲0.1401 mg/mL)10 mL，按2.2.2 项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，测定峰面积，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)Table 1 Results of recovery tests (n=6)

2.4 样品测定

取3 批样品，分别按2.2.2 项下方法制备样品溶液，照2.1 项下条件测定，计算供试品中栀子苷和五味子醇甲的含量，结果见表2。

表2 样品测定结果(n=3)Table 2 Contents of jasminoidin and schisandrae detected in 3 batches of samples (n=3)

3 讨论

3.1 测定波长的选择

颐脑解郁颗粒中栀子苷和五味子醇甲这2 种指标成分的最大吸收波长不同，通过紫外全波长扫描的光谱图可知，栀子苷在238 nm 处有最大吸收，五味子醇甲在250 nm 处有最大吸收。试验中曾考察用同一个波长测定这两个指标成分，发现分离效果不是很好，故选择双波长法，使这两个指标成分在各自最大吸收波长下测定，以获得最佳的检测效果。

3.2 流动相的选择

本实验考察了不同溶剂系统，如乙腈-水、甲醇-水对色谱峰分离效果的影响。结果表明以不同比例的乙腈-水为流动相的分离效果不是很理想，以甲醇-水进行梯度洗脱，可将待测组分完全分离，缩短分析时间。故选择甲醇-水作为流动相。

3.3 提取条件的选择

试验过程中对供试品溶液的处理方法进行了考察，首先采用超声提取和回流提取这两种方法进行考察。结果表明:两种提取方法的提取效率比较接近，但超声提取方法操作简便、快捷，故本实验确定以超声处理作为提取方法。又分别采用甲醇、乙醇、水这三种不同的溶剂超声提取，并对不同提取时间进行比较试验，实验中将样品分别超声20、30、40 min 后测定栀子苷和五味子醇甲的含量。结果表明，用甲醇作溶剂，超声30 min 处理样品为最佳，可使样品中的栀子苷和五味子醇甲提取完全。

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