经典及改进的CUPRAC 法在多组分抗氧化剂活性研究中的应用

李 辉，王晓飞，焦海胜

1兰州大学药学院，兰州 730000;2 兰州大学第二医院药学部，兰州 730030

20 世纪80 年代以后，随着分子生物学和医学的发展，人们对生物体中包含的大量自由基反应及其对人体产生的危害有了越来越多的认识。机体内的抗氧化防御系统一旦失衡，就会产生氧化损伤，进而导致细胞活力下降、机体衰老、血管病变、细胞癌变、糖尿病及并发症等80 余种疾病［1-3］。减少机体氧化损伤的最有效方法是补充抗氧化剂。为了测定抗氧化剂活性，建立了多种方法。根据反应机制的不同可将这些方法分为两种，即基于质子转移(TRAP 法和ORAC 法)和基于电子转移(DPPH 法、ABTS 法和FRAP 法)的方法［4，5］。TRAP 法以不稳定的氧化电极作为反应终点指示剂，由于各抗氧化剂的反应终点不同，因此各个实验室缺乏可比性。ORAC 法选用的荧光探针为β-藻红蛋白，不同批次的荧光探针差别很大［6］，此外，检测对温度、氧化剂、荧光标记物和样品浓度较为敏感［7］，重复性较差。DPPH 法所用的DPPH·试剂溶于亲脂性溶剂，其只可以用于检测亲脂性抗氧化剂的抗氧化活性［8］，且其在溶液中对光、空气中的氧及pH 值敏感，不能很好的反映抗氧化物质的活性［7］。ABTS法所选用的ABTS·+虽然既溶于亲水性溶剂又溶于亲脂性溶剂，但由于其是以氮为中心的自由基，空间位阻较大，与抗氧化活性物质酚类聚合物反应的速率较慢［9］。FRAP 法测定环境pH3.6，其所处的环境与体液不同，此外由于FRAP 属于电子转移(SET)反应，其不能测定氢转移(HET)的起作用的物质，尤其是巯基和蛋白，如谷胱甘肽［10］。由于这些方法存在的缺点，需要联合采用多种方法反映多组分混合物的总抗氧化活性［11］。为了克服以上缺点，Apark R 等建立了CUPRAC 方法用于测定多组分混合物的抗氧化活性。通过改进本方法，可用于同时测定亲脂性和亲水性抗氧化剂活性、检测维生素C 和黄酮类化合物混合物中维生素C 含量、筛选多组分中抗氧化剂等。本文综述了经典及改进的CUPRAC 法在多组分抗氧化剂活性研究中的应用，同时探讨了其优点和不足。

1 经典的CUPRAC 法

经典的CUPRAC 法由土耳其伊斯坦布尔大学Apark R 课题组首次建立［12］，所选用的试剂为CuCl2-新亚铜灵(Nc)试剂。其反应原理如图1 所示。

图1 CUPRAC 法反应原理Fig.1 Reaction principle of CUPRAC method

在CuCl2溶液中依次加入NH4Ac 缓冲溶液(pH7.0)、Nc 溶液，生成Cu2+-Nc，显淡蓝色。加入抗氧化剂后其与Cu2+-Nc 反应生成Cu+-Nc 和H+，其中Cu+-Nc 显黄色在450 nm 处有最大吸收，H+被NH4Ac 缓冲溶液中和［13］。Cu2+-Nc/Cu+-Nc 的氧化还原电位(0.7V)比Cu2+/Cu+的氧化还原电位(0.16V)高，因此多酚类抗氧化剂与Cu2+-Nc/Cu+-Nc 的反应比与Cu2+/Cu+的快［13］。

Apark R 等指出经典的CUPRAC 法测定抗氧化剂时，测定条件(混合时间、混合温度、溶媒pH)对检测结果影响较大［12，14］。研究表明，当室温下混合30 min 时，一些与Cu2+-Nc 反应较快的抗氧化剂(如维生素C、没食子酸和槲皮素)，采用CUPRAC法测定的抗氧化活性与实际较一致;而50 ℃混合20 min 时，一些与Cu2+-Nc 反应较慢的抗氧化剂(如柚皮苷、柚皮素、尿酸和胆红素)，采用CUPRAC法测定的抗氧化活性与实际较一致;黄酮苷类抗氧化剂，水解后采用CUPRAC 法测定的抗氧化活性与实际较一致［12，14］。此外，Celik SE 等还研究了溶剂对CUPRAC 法检测结果的影响［15］，研究结果表明，不论何种抗氧化剂(亲脂性和亲水性)的抗氧化活性均可采用CUPRAC 法在极性和非极性溶剂中进行测定，采用CUPRAC 法测定的抗氧化活性随着溶剂的溶解性、介电常数及类型的变化而变化，但在乙醇/水溶液中其随溶剂的溶解性、介电常数的变化较小。同时，Apark R 等指出在采用CUPRAC 法测定多组分抗氧化剂时，需要采用氮气排除溶液中的氧气，以免其中的氧气影响检测结果;由于CuCl2-Nc试剂与抗氧化单体的反应速度比氧气快，因此在测定抗氧化单体时则不需要排除溶液中的氧气［13］。

经典的CUPRAC 法在多组分抗氧化活性测定中的应用见表1。

表1 经典的CUPRAC 法在多组分抗氧化活性测定中的应用Table 1 The application of main CUPRAC method in determination of antioxidant activity of multicomponent

2 改进的CUPRAC 法

2.1 同时测定亲脂性和亲水性抗氧化剂活性的CUPRAC 法

采用CUPRAC 法的测定抗氧化活性随着溶剂的溶解性、介电常数及类型的变化而变化，由于不同抗氧化剂(亲脂性和亲水性)在溶剂中的溶解性不同，因此很难采用CUPRAC 法在同一溶剂中同时测定亲脂性和亲水性抗氧化剂的抗氧化活性。为了克服以上缺点，Özyürek M［24］等对CUPRAC 法进行了改进，改进的措施包括采用溶有甲基-β-环糊精的丙酮-水(1∶9，v/v)溶液溶解样品，由于有甲基-β-环糊精呈筒状结构，其两端与外部为亲水性，而筒的内部为疏水性，其借 范德华力将一些大小和形状合适的亲脂性抗氧化剂包含于筒状结构中，增加亲脂性抗氧化剂在丙酮-水(1∶9，v/v)溶液的溶解性。此外，他们还对甲基-β-环糊精在丙酮-水(1∶9，v/v)溶液中的浓度进行了优化，研究结果表明，当甲基-β-环糊精在丙酮-水(1∶9，v/v)溶液中的浓度为2%时测定结果最好。

2.2 用于检测维生素C 和黄酮类化合物混合物中维生素C 含量的CUPRAC 法

采用CUPRAC 法的测定抗氧化活性时，多种抗氧化剂均能与Cu2+-Nc 反应，生成Cu+-Nc，在450 nm 处有最大吸收。因此，在测定抗氧化剂维生素C的含量时，其他抗氧化剂(如黄酮类化合物)会产生干扰。为了测定抗氧化剂维生素C 的含量，Özyürek M［25］等对CUPRAC 法进行了改进以便排除黄酮类化合物的干扰。改进的措施包括在待测样品中加入LaCl3溶液，然后采用乙酸乙酯萃取，由于La3+与黄酮类化合物反应，生成La3+-黄酮类化合物复合物，该复合物溶于水，采用乙酸乙酯萃取后，维生素C可富集与有机相中。此外Özyürek M［25］等还研究了排除芦丁干扰的方法。芦丁由于其具有3-O-芸香糖基团，不能与LaCl3反应，因此再加入LaCl3溶液之前，须对待测样品进行水解。

2.3 用于筛选多组分中抗氧化剂的CUPRAC 法

经典的CUPRAC 法只能测定多组分抗氧化剂的抗氧化活性，不能筛选多组分中的抗氧化剂。为了筛选多组分成分中的抗氧化剂，Celik SE［26］等建立了在线HPLC-柱后CUPRAC 法用于筛选多组分中的抗氧化剂。其筛选系统结构如图2 所示。

图2 在线HPLC-柱后CUPRAC 法技术筛选多组分中抗氧化剂系统结构［26］Fig.2 Flow chart of screening the antioxidant compounds from multicomponent by HPLC-CUPRAC assays ［26］

在该方法中，天然产物经HPLC 分离，流出物在柱后进入活性检测单元与Cu2+-Nc 作用后，利用作用前后在517 nm 处吸光度的变化，即作用后在色谱图中形成倒峰，进行抗氧化剂的筛选。此外，Celik SE［26］等还对Cu2+-Nc 的浓度及流速进行了优化，研究结果表明，在筛选维生素E 时，Cu2+-Nc 的浓度为3.33 mmol/L Cu2+/2.5 mmol/L Nc/333 mmol/L NH4Ac、Cu2+-Nc 的流速为0.5 mL/min 时，筛选灵敏度最高。

2.4 用于测定抗氧化剂羟自由基清除活性的CUPRAC 法

羟自由基与某些疾病及衰老有着密切的关系，为了测定水溶性抗氧化剂羟自由基清除活性，Bektasoĝlu B［27］对CUPRAC 法进行了改进。在改进的CUPRAC 法中，羟自由基由Fe2+-EDTA 与过氧化氢反应生成，以2，4-二甲氧基苯甲酸、3，5-二甲氧基苯甲酸或p-氨基苯甲酸为探针物质，当加入抗氧化剂时，抗氧化剂与探针物质竞争性的与羟自由基反应，反应2 h 后，加入HCl 终止反应，其中由探针物质与羟自由基反应生成的羟基化探针物质由乙酸乙酯富集于有机相，其可以与Cu2+-Nc 反应，生成Cu+-Nc，在450 nm 处有吸收。通过测定A0/A 可以反应水溶性抗氧化剂羟自由基清除活性，其中A0为未加入抗氧化剂时的吸光度;A 为加入抗氧化剂的吸光度。

另一种测定氧化剂羟自由基清除活性的CUPRAC 法 由Özyürek M［28］等 建 立。该 方 法 与Bektasoĝlu B 建立的方法相比较，其采用水杨酸作为探针物质，加入抗氧化剂时，抗氧化剂与探针物质竞争性的与羟自由基反应，反应10 min 后，加入过氧化氢酶与过量的过氧化氢反应，以减少过氧化氢产生的干扰。

2.5 用于测定抗氧化剂黄嘌呤氧化酶抑制活性的CUPRAC 法

Özyürek M［29］等对CUPRAC 法进行了改进用于测定多酚及黄酮类化合物黄嘌呤氧化酶抑制活性。在改进的方法中黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化下于37 ℃反应30 min，生成尿酸与过氧化氢，尿酸与过氧化氢均能与Cu2+-Nc 反应，生成Cu+-Nc，在450 nm 处有吸收。当加入抗氧化剂时，抗氧化剂由于具有黄嘌呤氧化酶抑制活性，抑制了生成尿酸与过氧化氢的生成，进而抑制了450 nm 处的吸收。因而1-A0/A 可以表示抗氧化剂的黄嘌呤氧化酶抑制活性。其中A0为未加入抗氧化剂时的吸光度;A 为加入抗氧化剂的吸光度。此外，Özyürek［29］等还对溶液pH及反应时间进行了优化，研究结果表明，当溶液pH值在6-9，反应时间为30 min 时，测定结果最好。

2.6 用于测定抗氧化剂过氧化氢清除活性的CUPRAC 法

Özyürek M［30］等对CUPRAC 法进行了改进用于测定多酚及黄酮类化合物过氧化氢清除活性。在改进的方法中过氧化氢可与Cu2+-Nc 反应，生成Cu+-Nc，在450 nm 处有吸收;当加入抗氧化剂时，在氯化铜的催化下，过氧化氢首先与抗氧化剂反应。因此通过测定以下三种溶液与Cu2+-Nc 反应的吸光度值：a) H2O2+CuCl2;b) H2O2+CuCl2+抗氧化剂;c) H2O2+CuCl2+抗氧化剂+过氧化氢酶，以［A0-(A1-A2)］/A0表示抗氧化剂的过氧化氢清除活性，其中A0为溶液a 与Cu2+-Nc 反应的吸光度值;A1为溶液b 与Cu2+-Nc 反应的吸光度值;A2为溶液c 与Cu2+-Nc 反应的吸光度值。此外Özyürek M［30］等还优化了溶液a、b、c 混合时间，研究表明，混合30 min后，其与Cu2+-Nc 反应的吸光度值趋于稳定。

2.7 用于测定含巯基蛋白抗氧化活性的CUPRAC法

Çekiç SE［31］等对CUPRAC 法进行了改进用于测定含巯基蛋白的抗氧化活性。该方法与经典的CUPRAC 法比较，由于NH4Ac 缓冲溶液可使蛋白沉淀，其采用了尿素缓冲溶液取代NH4Ac 缓冲溶液。

2.8 用于测定多组分抗氧化活性的基于CUPRAC法的光学感应器

为了将CUPRAC 法制作成便于携带的检测试剂盒，Benner M［32］等发明了基于CUPRAC 法的光学感应器。该感应器的制作方法如下：首先将聚四氟乙烯离子交换薄膜浸泡于2 mL 的1.0 ×10-2mol/LCuCl2-Nc+2 mL 的7.5 ×10-3mol/L Nc +2 mL 的1.0 mol/L NH4A+2.2 mL 的H2O 中，摇动30 min，取出聚四氟乙烯薄膜，即得基于CUPRAC 法的光学感应器。该感应器测定多组分抗氧化活性的过程如下：将该感应器置于所测多组分的乙醇溶液中摇动30 min 以生成Cu+-Nc，然后将光学感应器置于盛有水的比色皿中，以防止感应器附着于比色皿壁上，于450 nm 处检测。

3 结论

由于抗氧化反应的复杂性和多样性，目前测定物质抗氧化活性的方法虽然很多，但还没有统一的标准的测定方法和和测定参数，相信随着CUPRAC法的引进，CUPRAC 法与其他抗氧化活性测定方法的联合应用能更加准确的反映多组分抗氧化剂的活性。

此外，经典和改进CUPRAC 法多用于抗氧化活性的测定，其在多组分物质中抗氧化剂筛选方面的研究较少。目前文献报道的有以Cu2+-Nc 为活性检测试剂的HPLC-柱后生物活性检测在线联用技术，由于该方法需要对HPLC 仪器进行改装，该装置目前尚未商品化。相信以的Cu2+-Nc 为显影试剂的TLC 自显影技术将会应用于多组分物质中抗氧化剂的筛选。

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