骨髓间充质干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠星形胶质细胞的影响Δ

杨晓帆 ，韩鹏飞，臧兆萍，陈 培 (1.牡丹江医学院红旗医院神经内科，黑龙江 牡丹江 157011; .牡丹江医学院红旗医院检验科，黑龙江牡丹江 157011; .齐齐哈尔医学院附属第一医院神经内科，黑龙江齐齐哈尔 16101; .牡丹江医学院病理生理教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

帕金森综合征是一种常见的神经系统变性疾病，患者中脑黑质多巴胺能神经元会发生变性坏死，纹状体多巴胺含量也会出现显著减少，对人体的危害极大。随着神经干细胞的成功分离、纯化以及体外扩增和定向诱导分化等技术的成熟，其已成为研究治疗帕金森综合征的热点。通过对骨髓间充质干细胞进行体外诱导，可以得到相应的神经干细胞，神经干细胞经诱导后能分化为功能性的纹状体多巴胺能神经元，细胞替代治疗通过移植可分泌多巴胺的细胞到脑内，对患者的大脑功能予以重建，达到治疗疾病的目的［1］。本研究中探讨骨髓间充质干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠星形胶质细胞的影响，为临床治疗提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 材料

SD 大鼠30 只，均为雄性、成年，体质量180 ～200 g，均由南京君科生物工程有限公司提供。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，试验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求，试验试药与仪器情况见表1。

表1 试验试药与仪器Tab 1 Experimental drugs，reagent and instrument

1.2 方法

30 只SD 大鼠按随机数字表法分为假手术组、观察组和对照组，每组10 只。构建局灶性脑缺血模型，采用全细胞贴壁法进行骨髓间充质干细胞体外培养。假手术组大鼠进行颈部切开并分离颈内动脉，且不做任何处理;观察组大鼠进行骨髓间充质干细胞移植治疗;对照组大鼠给予等量磷酸盐缓冲液。干细胞移植之后利用多聚甲醛进行心脏灌注，死亡后取脑，常规制成石蜡块并切片。进行免疫荧光双标检测，检测GFAP 与二脒基苯基吲哚( 4'6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 以及骨形态发生蛋白4( bonemorphogeneticprotein4，BMP4) 与DAPI 的双阳性表达情况。具体方法为： 修复后利用正常山羊血清进行封闭处理，添加鼠抗人GFAP 单克隆抗体或兔抗BMP4，4 ℃并向过夜，过夜PBD 洗涤，添加山羊抗小鼠IgG 进行孵育，置荧光显微镜下观察GFAP+DAPI+与BMP4+DAPI+细胞数目，并进行甲苯胺蓝染色，置于光学显微镜下进行计数，计数缺血侧脑神经元。

1.3 统计学方法

本次研究过程中得到的所有研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件，并进行处理。计量资料符合正态分布的予以t检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析，并进行相关性分析。检测P值，如果经检测P＜0.05，则提示2 组数据间的差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠神经元数目比较

局灶性脑缺血模型大鼠的神经细胞均呈现出排列不整齐的情况。假手术组大鼠的神经元数目为(1 125.12±75.13)个/mm2，对照组大鼠的神经元数目为(655.12 ±53.15) 个/mm2，观察组大鼠的神经元数目为(815.12 ±55.65) 个/mm2。与假手术组比较，观察组和对照组大鼠的神经元数目明显偏少，差异均有统计学意义(P＜0.05) 。

2.2 3 组大鼠免疫荧光双标结果比较

对照组大鼠可观察到大量的GFAP+DAPI+细胞和BMP4+DAPI+，且数量明显多于假手术组和观察组，差异有统计学意义(P＜0.05) ，见表2。

表2 3 组大鼠免疫荧光双标结果比较(个/mm2，¯x±s)Tab 2 Comparison of double-labelling immunofluorescence between three group of rats(neurons/mm2，x¯±s)

2.3 BMP4 蛋白和GFAP 蛋白相关性分析

BMP4 蛋白和GFAP 蛋白之间具有一定的相关性。其中，GFAP+DAPI+细胞数和BMP4+DAPI+细胞数之间呈现出直线回归，见图1。

图1 BMP4 蛋白和GFAP 蛋白现回归分析图Fig 1 Regression analysis diagram of BMP4 and GFAP protein

3 讨论

人体内的神经细胞和心肌细胞、骨骼肌细胞一样属于永久细胞，即不可再生细胞，因此，神经细胞死亡所导致的疾病对人体损害不可逆转，目前的治疗手段只能延缓疾病进展，或恢复尚未完全坏死的神经细胞功能［2］。

帕金森病为临床较为常见的神经系统变性疾病，在中老年群体中具有较高的发病率。患者中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死和纹状体多巴胺含量明显减少，临床大多表现出不同程度的静止性震颤、肌强直、动作迟缓、姿势及步态异常等运动症状，并伴有各种非运动症状，包括焦虑、抑郁、痴呆、睡眠障碍、体位性体血压等。帕金森病起病时多为一个或一侧肢体发病，随时间推移波及对侧。常规治疗方法包括保护神经以及改善微循环，左旋多巴治疗等。常规治疗在控制症状方面虽然可以取得一定的疗效，但长期用药后会出现药物失效或运动障碍等不良作用。随着干细胞技术的不断发展，临床开始积极的尝试利用不同的干细胞对帕金森患者进行治疗［3］。目前，应用较多的干细胞为神经干细胞。

神经干细胞是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，能够分化产生神经组织中不同细胞类型的细胞，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。神经干细胞对神经系统的发育、神经组织稳态的维持和损伤的修复起着重要的作用，其功能失调与许多神经退行性疾病的发生和发展密切相关［4］。神经胶质细胞的主要组成部分之一便是星形胶质细胞，在出现脑缺血后，星形胶质细胞会被激活，并发挥出重要的作用，对神经干细胞的分化予以调控，以达到修复脑损伤的目的［5］。星形胶质细胞并不是神经细胞，而是以支持神经细胞作用为主要目的，包括提供营养、做为神经细胞之间的绝缘体，以免神经细胞之间电传导过程传递讯息时出错、如架子一般支撑起神经细胞、引导神经细胞延伸生长等等［6］。

干细胞是人体发育进化的最小单位，骨髓间充质干细胞即为一种重要的干细胞类型［7］。间充质干细胞具有多向分化的能力，在一定的体外条件下，经一定的诱导可以获得神经细胞等，并被应用于各种治疗之中［8］。骨髓间充质干细胞具有多向分化的特点，在一定的体外环境下，可以发生分离和扩增，然后对其进行回输，可以定位于骨髓，并随着时间的推移发生自我更新，因此实现在体内长期的存活［9］。张海燕等［10］通过研究发现，在一定的体外诱导条件下，大鼠骨髓间充质干细胞具有分化成神经细胞或星形胶质细胞的可塑性。本次研究中可以观察到局灶性脑缺血模型大鼠的神经细胞呈现出排列不整齐的情况，且较之假手术组，神经元数目明显偏少。这一结果表明，本次研究区过程中局灶性脑缺血模型的制作是成功的。研究结果还显示，观察组大鼠的神经元数目明显多于对照组，表明经骨髓间充质干细胞侧脑室移植治疗之后，可以有效减轻局灶性脑缺血性大鼠的脑损伤程度。对照组大鼠可观察到大量的GFAP+DAPI+细胞，且数量明显多于假手术组和观察组。其原因可能为经骨髓间充质干细胞移植治疗可有效减少大鼠缺血侧脑星形胶质细胞的形成，表明骨髓间充质干细胞以及神经干细胞均可在大鼠脑内发生分化，形成神经元和神经元样细胞以及星形胶质细胞等［11］。而这些细胞可以发生整合，并积极的参与多巴胺神经的环路重建过程之中，达到改善脑损伤的目的［12］。BMP4 蛋白属于形成蛋白家族，可以对神经干细胞向星形胶质细胞的分化产生十分积极的促进作用，并对胶质细胞和神经元的平衡予以有效的调控［13］。本次研究发现，BMP4 蛋白和GFAP 蛋白之间具有一定的相关性，BMP4 蛋白会对GFAP 蛋白的表达产生一定的影响，说明在经过骨髓间充质干细胞移植之后，对照组大鼠缺血侧脑星形胶质细胞表达的减少和BMP4 蛋白表达水平的下降之间存在一定的关系。

综上所述，骨髓间充质干细胞移植后，可以有效减少局灶性脑缺血大鼠的脑星形胶质细胞的形成，发挥出细胞保护机制，减轻脑损伤，且其机制与BMP4 蛋白表达水平的下降之间存在一定的关系。研究也为骨髓间充质干细胞治疗局灶性脑缺血疾病提供了一定的理论依据，具体问题尚需进一步探讨。

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