9顺维A酸对人肺腺癌细胞A2增殖及凋亡影响的实验研究

酆 渊， 茆 勇， 游庆军， 徐静静*

9顺维A酸对人肺腺癌细胞A2增殖及凋亡影响的实验研究

酆 渊1， 茆 勇2， 游庆军2， 徐静静*2

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122；2.江南大学 附属医院，江苏 无锡214062）

研究9顺维A酸（9-cis RA）抑制肺腺癌细胞A2增殖及诱导凋亡的作用并初步探讨其作用机制。体外培养A2细胞，随机分为4组，实验组加9-cis RA使其终浓度为1、5、10 μmol/L，对照组加入二甲亚砜使其终质量分数为0.1%，采用MTT法检测各组A2细胞增殖情况；使用流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析药物作用后各组细胞的凋亡率；用逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）检测各组细胞bax、fas、bcl-2基因的变化。9顺维A酸对人肺癌细胞株A2增殖均有明显的抑制作用（P＜0.01），实验组中细胞凋亡发生率显著增高（P＜0.05），且随着浓度的升高抑制作用和凋亡率也随之提高。实验组bax mRNA、fas mRNA表达显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；实验组bcl-2 mRNA表达显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论9-cis RA具有明显的抗肺腺癌细胞A2增殖的作用，其机制可能通过上调bax、fas基因和下调bcl-2基因表达、诱导细胞凋亡有关。

9-顺维A酸；肺癌；细胞增殖；细胞凋亡

维A酸广泛存在于鱼肝油、动物肝脏、奶油、深色蔬菜以及橘色蔬菜水果之中。已证实维A酸类化合物能调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动[1-2]，最近的研究表明维甲酸类化合物通过与核维甲酸受体（RARs）及核维甲酸类X受体（RXRs）结合发挥其生物学效应，在已知的维甲酸类化合物中，9-顺维甲酸（9-cis RA）唯一能与这两类核受体结合，因为其生物学活性强于其他维甲酸类化合物而倍受瞩目[3-4]。作者旨在观察9-cis RA诱导肺癌细胞株凋亡与bax、fas和bcl-2基因表达的关系，为9-cis RA临床治疗肺癌提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

9-cis RA，纯度98%，购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养液：购自中科院上海细胞所；胎牛血清：购自美国Sigma公司；M-MLV逆转录酶试剂盒：购自美国Bio Basic公司；PCR MasterMix试剂：购自美国Fermentas公司；凝胶电泳用琼脂糖：购自美国Bio Basic公司；PCR相关试剂及引物合成：购自上海生工生物技术有限公司；人肺腺癌细胞株A2：北京中日友好医院提供。

1.2 实验方法

A2细胞在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，培养液RPMI含体积分数10%灭活小牛血清及青、链霉素各100 U/mL，所有用于实验的细胞均处于对数生长期。用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成1×105/mL细胞悬液，接种细胞于 96孔培养板中，每孔100 μL，置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱内培养24 h后，加入9-cis RA，使实验组9-cis RA终浓度依次为1、5、10 μmol/l，阴性对照组不含9-cis RA。每浓度设3个复孔，各组分别培养 48 h后，按MTT细胞增殖检测试剂盒操作步骤进行操作。

以上4组细胞分别培养 48 h后，用不含EDTA的质量分数0.25%胰酶消化，然后分别按以下两步骤操作：①用PBS洗涤细胞两次（2 000 r/min离心，5min）收集细胞，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC混匀后，再加入5 μL的Propidium Iodide混匀，室温、避光、反应5～15 min后，在1 h内用流式细胞仪定量分析细胞凋亡水平。实验重复3次；② 按Trizol试剂说明书提取总 RNA，引物序列使用Primer Premier 5.0软件设计并在NCBI上进行BLAST对比，引物均由上海生工生物技术公司合成，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组bax、fas、bcl-2 mRNA表达变化。

1.3 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差（x±s）表示，组间分析采用单向方差分析 （One-Way-ANOVA）多重比较进行检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 9-cis RA对A2细胞增殖的抑制作用

9-cis RA对人肺癌细胞株A2增殖均有明显的抑制作用（P＜0.01），且随着浓度的提高抑制率也随之提高，结果见表1。

2.2 9-cis RA对A2细胞作用48h后，对A2细胞凋亡率的影响

不同浓度9-cis RA作用于肺癌细胞A2 48 h后，经流式细胞分析仪检测。结果显示：对照组凋亡率为（6.28±0.23）%；9-cis RA（1 μmol/l）组凋亡率为（10.07±0.53）%；9-cis RA（5 μmol/l）组凋亡率为（10.63±0.14）%；9-cis RA（10 μmol/l）组凋亡率为（15.45±0.41）%。经随机区组设计的单因素ANOVA统计软件分析结果显示：与对照组的细胞凋亡率相比，不同浓度9-cis RA组均有所增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；但9-cis RA（1 μmol/l）组与9-cis RA（5 μmol/l）组凋亡率差异不明显（P＞0.05）。

表1 各组光密度值和细胞抑制率比较Table 1 Comparison of optical density values and cell inhibition rates in each group

2.3 各组bax mRNA、fas mRNA、bcl-2 mRNA表达变化

与对照组相比，实验组 bax mRNA、fas mRNA表达显著高于对照组，bcl-2 mRNA表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。RTPCR检测目的基因的变化结果见图1～3。

表2 各组作用A2细胞48 h后，目的基因和 β-actin mRNA灰度比Table 2 mRNA gray ratio of target genes to beta-actinin A2 cells after 48 h

表2 各组作用A2细胞48 h后，目的基因和 β-actin mRNA灰度比Table 2 mRNA gray ratio of target genes to beta-actinin A2 cells after 48 h

与对照组比较：*P＜0.05。

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图1 RT-PCR检测各组bax基因mRNA表达Fig.1 Expression of bax mRNA by RT-PCR

图2 RT-PCR检测各组fas基因mRNA表达Fig.2 Expression of fas mRNA by RT-PCR

图3 RT-PCR检测各组bcl-2基因mRNA表达Fig.3 Expression of bcl-2 mRNA by RT-PCR

3 讨论

已知细胞内的维甲酸受体有两种形式：即核维甲酸受体（RARs）和核维甲酸类X受体（RXRs），9-cis RA进入细胞后可与这两类受体结合。目前认为，RARs-RXRs复合体是9-cis RA发挥作用的真正受体形式，9-cis RA与受体复合物结合后，激活DNA上特异的维甲酸识别元件，进而影响转录机制，抑制相关原癌基因和（或）诱导抑癌基因表达，发挥其抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡作用。国外研究发现9-cis RA在低浓度时作用较弱，而在较高浓度（＞10-6mmol/L）对神经母细胞瘤的增殖具有明显抑制作用，并能诱导神经母细胞瘤的凋亡[5]。作者研究发现，实验组中凋亡发生率显著高于对照组，而且10 μmol/L 9-cisRA抑制肺癌细胞A2增殖和诱导凋亡作用显著高于1 μmol/L组和5 μmol/L组，也呈现浓度依赖性，与国外的相关研究成果一致。

研究证实9-cisRA诱导肺癌细胞凋亡的机制可能有：通过Rb基因表达增加和cyclinD1基因表达减少途径诱导肺癌细胞凋亡；通过凋亡抑制基因bcl-2家族对肿瘤细胞的凋亡实施调控。游庆军[6-7]等人研究认为9-cisRA可能引起抑癌基因Rb表达增加和原癌基因cyclinD1表达减少，结合转录因子E2F，使癌细胞阻滞在G1期，阻止分化期中的细胞增殖，直接诱导肺癌细胞凋亡或通过影响P53、cmyc、E1A等基因的表达启动细胞凋亡途径。更多的研究显示肿瘤细胞凋亡的调控可能与死亡受体信息转导通路中Fas/FasL基因的异常表达有关。研究表明9-cisRA通过上调肺癌细胞中fas基因的表达来实现对Fas/FasL信号系统的调控，同时通过降低bcl-2 mRNA和提高bax mRNA表达促进细胞凋亡。

Fas属于肿瘤坏死因子受体（也称死亡受体）家族，是细胞膜上的糖基化穿膜蛋白，在细胞凋亡过程中发挥着传递细胞凋亡信号作用。细胞表面表达的Fas与FasL交联后，形成能传达信号的活性三聚体 （死亡结构域DD），Fas与死亡结构域相关蛋白（FADD）形成二聚体，将凋亡信号传导至凋亡蛋白酶caspase-8，进而引起一系列酶联反应，激发下游caspase-3、6、7，最终导致细胞凋亡[8]。作者用RTPCR检测的结果显示实验组fas表达明显高于对照组。Bcl-2属膜蛋白，主要存在于线粒体内膜、细胞膜内表面、内质网膜、溶酶体膜、核膜等处。Bcl-2具有恢复线粒体内膜的跨膜电位和关闭线粒体膜通透性转换孔的作用，可使线粒体膜通透性降低，阻止凋亡启动因子释放，切断细胞凋亡级联反应中关键环节，如抑制促进凋亡的蛋白Bax的毒性作用、抑制caspase激活、维持细胞能钙的稳定等，具有很强的抗凋亡作用；Bax主要促进细胞凋亡。当Bcl-2过表达时，与Bax形成异二聚体抑制细胞凋亡；相反，Bax过表达时，Bax形成同源二聚体促进细胞凋亡。Bcl-2和Bax对细胞凋亡的调控不仅取决于自身表达水平高低，还与两者的比例有关，当Bcl-2/ Bax比例减少时，细胞趋于凋亡[9-10]。实验结果显示，实验组bcl-2表达明显低于对照组、bax表达明显高于对照组，细胞凋亡增加。9顺维甲酸诱导肺癌细胞A2凋亡可能与fas、bax表达增加，bcl-2表达减少有关，是通过死亡受体途径及线粒体途径引起细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。

综上所述，9顺维甲酸具有抑制肺腺癌细胞增殖、促进肺癌细胞凋亡的作用，其机制可能是通过阻滞细胞周期、提高bax、fas基因的表达，降低bcl-2基因的表达实现的，为提高肺癌的治疗效果提供一种新的途径。

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Effects of 9-Cis-Retinoic Acid on the Proliferation and Apoptosis of Human Lung Cancer Cell Line A2

FENG Yuan1， MAO Yong2， YOU Qinjun2， XU Jingjing*2
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Affiliated Hospital，Jiangnan University，Wuxi 214062，China）

The study aimed to explore the mechanism of 9-cis-retinoic acid（9-cis RA）inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human lung cancer cell line A2.Cultured A2 cells were randomly divided into four groups，the experimental group received 9-cis RA to a final concentration of 1，5 or 10 μmol/L，and the control group was added dimethyl sulfoxide to a final concentration of 0.1%.The MTT method was used for the determination of cell proliferation，flow cytometry（FCM）for the analysis of apoptosis，and reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）for the expression changes of bax，fas and bcl-2 genes.Results showed that 9-cis RA significantly inhibited the cell proliferation（P＜0.01）and the incidences of apoptosis in the experimental groups weresignificantly higher（P＜0.05），which depended on the concentration of 9-cis RA.The mRNA expressions of bax and fas genes in the experimental groups were significantly higher（P＜0.01）whereas the bcl-2mRNA expressionwas significantly lower than the control group（P＜0.01）. Therefore，9-cis RA significantly inhibitsthe proliferation of human lung cancer cell line A2，which may be related to the increased expressions of bax and fas genes and the decreased expression of bcl-2 gene，and then induced apoptosis.

9-cis-retinoic acid，lung cancer，cell proliferation，apoptosis

R 734.2

A

1673—1689（2015）07—0779—05

2014-08-20

无锡市医院管理中心重大项目（YGZX1210）。

*通信作者：徐静静（1983—），女，江苏泰州人，助理研究员，主要从事抗肿瘤药物机理研究。E-mail：wxsytsg@126.com