纳豆激酶微胶囊的研制初探

孙建华，曲晓军，王金英，王笑庸，于丽萍

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150020）

纳豆激酶微胶囊的研制初探

孙建华1,2，曲晓军1,2，王金英1,2，王笑庸1,2，于丽萍1,2

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150020）

本文主要就海藻酸钠对纳豆激酶包埋制备微胶囊的工艺优化进行初探。经过海藻酸钠包埋的纳豆激酶可以较好地保护酶的活性，免受外界环境的影响。同样，对于混合多糖的包埋研究发现，海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶，有粒径小、外观规则且酶活的回收率高、硬度强等优点。

纳豆激酶；海藻酸钠；微胶囊

纳豆激酶是1987年，由日本的须见洋行［1］等人首先从日本一种传统的发酵食品——纳豆——中分离出来的，主要是由枯草芽孢杆菌（Bacillus natto）产生的一种丝氨酸蛋白酶［1,2］发现并命名的纳豆激酶，经验证具有较好的溶栓降脂等效果。

本次实验选用的纳豆激酶样品是复合酶，本单位制备，其主要成分是纳豆激酶，同时还含有部分蛋白酶、淀粉酶，经预实验，若选择乳清蛋白及马铃薯淀粉等对其包埋会被纳豆激酶样品分解。故选用多糖对本次纳豆激酶样品进行包埋，避免被其分解。经海藻酸钠［3］包埋的纳豆激酶及纳豆激酶微胶囊，对内部结构及酶活都不会有太大的影响。

1 材料和方法

1.1 试验样品

纳豆激酶干粉：黑龙江省科学院微生物研究所研制。

其他化学试剂均为分析纯、生化纯。

1.2 试验方法

1.2.1 海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶

1.2.1.1 包埋率及酶活回收率的测定

实验结果中包埋率以及酶活回收率的计算，见公式（1）以及（2）所示。

式中b-包埋率(%);

m1-包埋的纳豆激酶的含量（g）；

m2-包埋的纳豆激酶的含量（g）；

h-酶活回收率（%）；

c1-包埋的纳豆激酶酶活；

c2-游离的纳豆激酶酶活。

包埋后的纳豆激酶含量测定时，需用超声波处理，使纳豆激酶从微胶囊中完全释放，然后按照液体纳豆激酶的含量进行测定。测定方法采用BCA试剂盒。纳豆激酶的活力测定采用的是纤维蛋白——琼脂糖平板法。

1.2.1.2 海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的单因素实验

第一，海藻酸钠浓度对包埋纳豆激酶的影响。用9.0 mL不同浓度的海藻酸钠溶液（1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%）与0.10 g纳豆激酶溶液，以及1.0 mL的0.40%的羧甲基纤维素钠（CMC）混合，用磁力搅拌器混合均匀后。然后用2.5 mL的注射器打入0.10%的CaCl2溶液中，凝固成小球后，静置0.5 h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl2溶液继续浸泡一定的时间，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗3次，再用滤纸吸干，装袋，放入4℃层析柜中备用。

第二，羧甲基纤维素钠浓度对包埋纳豆激酶的影响。用9.0 mL的1.6%的海藻酸钠溶液与0.10 g纳豆激酶溶液，以及1.0 mL不同浓度的羧甲基纤维素钠溶液（0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%）混合，用磁力搅拌器混合均匀后。然后用2.5 mL的注射器打入0.10%的CaCl2溶液中，凝固成小球后，静置0.5 h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl2溶液继续浸泡一定的时间，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗3次，再用滤纸吸干，装袋，放入4℃层析柜中备用。

第三，CaCl2溶液的浓度对包埋纳豆激酶的影响。用9.0 mL的1.6%的海藻酸钠溶液与0.10 g纳豆激酶溶液，以及1.0 mL的0.5%羧甲基纤维素钠溶液混合，用磁力搅拌器混合均匀后。然后用2.5 mL的注射器打入不同浓度的CaCl2溶液（0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.80%）中，凝固成小球后，静置0.5 h，然后滤出小球，换相同浓度的CaCl2溶液继续浸泡一定的时间，继续固定化，再次滤出小球，随后用蒸馏水冲洗3次，再用滤纸吸干，放入4℃层析柜中备用。

1.2.1.3 海藻酸钠包埋纳豆激酶的正交试验

由1.2.1.2单因素的优化条件的实验结果中选出不同的因素和水平进行正交，以期得到最佳的包埋效果。本实验中选取的因素是海藻酸钠浓度、羧甲基纤维素钠浓度以及CaCl2浓度进行实验，并以纳豆激酶的酶活回收率为评价指标，实验选取L9（34）进行正交实验。

1.2.1.4 混合多糖包埋纳豆激酶的酶活大小的比较

采用三种不同的包埋材料对纳豆激酶进行包埋，主要是海藻酸钠与羧甲基纤维素、海藻酸钠与卡拉胶、壳聚糖这三种不同的材料进行复合。按照一定的操作方法使其对纳豆激酶进行包埋，并以相应浓度的自由纳豆激酶的残余酶活为相对酶活100%，三种不同材料的残余酶活与其的比值为该材料包埋的纳豆激酶的相对酶活。

2 结果与分析

研究不同浓度的海藻酸钠对纳豆激酶的包埋率影响，实验结果如图1所示。

图1 海藻酸钠浓度对包埋率的影响Fig.1 The effect of sodium alginate concentration on the embedding rate

由图1可知，海藻酸钠包埋纳豆激酶的包埋率，随着海藻酸钠浓度的逐渐升高也是逐渐上升的，然后呈现下降的趋势。包埋率最高时的海藻酸钠浓度为1.60%。海藻酸钠浓度低时，包埋率相应较低，主要是因为加入的纳豆激酶的量达到过饱和状态，导致有部分纳豆激酶未被包上；海藻酸钠浓度高时，包埋率也相应较低，主要是因为海藻酸钠浓度过高，会影响纳豆激酶的释放，从而导致相应的包埋率也降低。

研究不同浓度的海藻酸钠对纳豆激酶酶活回收率的影响，实验结果如图2所示。

图2 海藻酸钠浓度对酶活回收率的影响Fig.2 The effect of sodium alginate concentration on the enzyme recovery rate

由图2可知，随着海藻酸钠浓度的增加，酶活回收率呈现的趋势是先逐渐升高后下降然后逐渐趋于平缓。并且在海藻酸钠浓度为1.60%的时候，酶活回收率为最高91.65%，为所有包埋的海藻酸钠浓度中的最高值。当海藻酸钠的浓度过大时，其溶液黏度很大，所形成的凝胶颗粒的体积过大，从而影响酶与底物的充分结合［4］。

研究不同浓度的羧甲基纤维素钠对纳豆激酶的包埋率的影响，羧甲基纤维素钠以其优良的黏结力、安全性，故选为包埋纳豆激酶的黏结剂。实验结果如图3所示。

图3 羧甲基纤维素钠浓度对包埋率的影响Fig.3 The effect of CMC concentration on the embedding rate

由图3可知，随着羧甲基纤维素钠浓度的逐渐升高，其对纳豆激酶的包埋率呈逐渐上升后下降的趋势，并且在羧甲基纤维素钠浓度为0.50%时，其对纳豆激酶的包埋率为所有浓度的最高值。

研究不同浓度的羧甲基纤维素钠对包埋纳豆激酶酶活回收率的影响，实验结果如图4所示。

图4 羧甲基纤维素钠浓度对酶活回收率的影响Fig.4The effect of CMC concentration on the enzyme recovery rate

由图4可知，随着羧甲基纤维素浓度的增加，固定化纳豆激酶酶活回收率的变化趋势为先上升后下降。在羧甲基纤维素钠的浓度为0.50%时，其酶活回收率是最高的。其主要原因是，当羧甲基纤维素钠的浓度过高时，导致混合体系的黏度增加，故而使纳豆激酶的活力下降。

研究不同浓度的CaCl2对豆激酶包埋率的影响，实验结果如图5所示。

图5 CaCl2浓度对包埋酶的影响Fig.5 The effect of CaCl2concentration on the embedding rate

由图5可知，CaCl2浓度的逐渐升高，海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的包埋率是呈现先升高后降低的趋势。并在CaCl2浓度为0.30%时，包埋纳豆激酶的包埋率达到最高。

研究不同浓度的CaCl2对包埋纳豆激酶酶活回收率的影响，实验结果如图6所示。

图6 CaCl2浓度对酶活回收率的影响Fig.6The effect of CaCl2concentration on the enzyme recovery

由图6可知，随着CaCl2浓度的不断的增加，纳豆激酶的酶活回收率也随之相应的先升高后降低。当CaCl2浓度为0.30%时，其纳豆激酶的酶活回收率为77.10%；当CaCl2浓度超过0.30%时，经包埋的纳豆激酶的酶活回收率的变化趋势逐渐趋于平缓。

经海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶的酶活回收率，随着CaCl2浓度的变化，其变化趋势是大致相同的。CaCl2的浓度主要影响的是所形成的凝胶的交联程度，CaCl2溶液的浓度越高，包埋酶颗粒的结构致密程度大大增加，凝胶内部的阻力也随之增大。因此，浓度大的CaCl2溶液会明显降低包埋酶的酶活力。

以单因素中的实验结果，选择海藻酸钠浓度为1.60%、羧甲基纤维素钠浓度为0.50%和CaCl2浓度为0.30%作为正交实验较优点，进行包埋纳豆激酶的正交实验。正交实验的因素如表1所示。

表1 正交实验因素水平表Tab.1 The factor and level of orthogonal experiment

海藻酸钠/CMC包埋纳豆激酶的正交实验因素以纳豆激酶的酶活回收率作为测定指标，以得到最佳的实验因素条件。按照L9（34）正交实验表设计的实验方案以及得到的实验结果如表2所示。

由表2可知，影响纳豆激酶酶活回收率的因素按其影响大小的排序为：羧甲基纤维素钠浓度＞海藻酸钠浓度＞CaCl2浓度。并且羧甲基纤维素钠浓度对酶回收率的影响是最大的，其极差远远大于其他两个因素。由正交试验的结果可知，包埋纳豆激酶的最优化条件是：海藻酸钠的浓度为1.80%，羧甲基纤维素钠的浓度为0.50%，CaCl2的浓度为0.30%。所得包埋酶的酶活回收率为最高，此条件为最佳优化条件。

表2 正交实验结果Tab.2 The results of orthogonal experiment

混合多糖包埋纳豆激酶的酶活大小的比较，实验结果如图7所示。

图7 不同包埋材料对酶活的影响Fig.7 The effect of different materials on enzyme recovery

由图7可知，经过三种不同材料包埋的纳豆激酶的相对酶活，相差无几。三种包埋的相对酶活的大小比较是：壳聚糖＞海藻酸钠与羧甲基纤维素钠＞海藻酸钠与卡拉胶。但是壳聚糖形成的包埋小球，因其硬度较小，易于受到外界条件的破坏，故还是选择海藻酸钠与羧甲基纤维素钠作为包埋材料。

3结论

本试验通过优选海藻酸钠、羧甲基纤维素钠及CaCl2的浓度对包埋纳豆激酶的包埋率和酶活回收率影响条件，筛选出包埋纳豆激酶的最优工艺条件是：海藻酸钠的浓度为1.80%，羧甲基纤维素钠的浓度为0.50%，CaCl2浓度的浓度为0.30%。与其他多糖包埋的纳豆激酶比较，海藻酸钠/CMC包埋的纳豆激酶，有以下优点：粒径小、外观规则并且酶活的回收率高、硬度强。本研究为纳豆激酶今后在药品及保健品中口服制剂的开发与应用提供了理论与实验依据。

［1］Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Experientia,1987,43（10）:1110-1111.

［2］Hsieh C W，Lu W C，Hsieh W C，et al.Improvement of the stability of nattokinase using γ-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation［J］. LWT-Food Science and Technology,2009,42（1）：144-149.

［3］张运铎.海藻酸钠功能特性应用研究进展［J］.河南科技（上半月），2011，（09）：56-57.

［4］郑璐.海藻酸钠固定化α-淀粉酶的研究［D］.武汉：华中农业大学，2013.

Preliminary Study about Preparation of Natto Kinase Microcapsules

SUN Jian-hua1,2,QUXiao-jun1,2,WANG Jin-ying1,2，WANG Xiao-yong1,2YU Li-ping1,2
（1.Institute of Microbiology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150010,China；
2.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences,Haerbin 150020,China)

In this paper,preliminary studies about process optimization of sodium alginate to natto kinase embedding preparation had been performed.It finds out that natto kinase embedded by sodium alginate can preserve the activity of enzymes better and protect the enzymes away from the impact of external environment.Meanwhile,the results of mixed polysaccharide embedding study show that natto kinase embedded by sodium alginate/CMC had some advantages as follows:small grain size,regular appearance,high recovery of enzyme activity and strong hardness.

Nattokinase；Sodium alginate；microcapsule

TQ464.8

A

1674-8646（2015）09-0004-04

2015-07-21

兼具整肠、调脂及调节免疫力的纳豆软胶囊保健食品的研制（KY14BSJH07）

孙建华（1961-），女，黑龙江哈尔滨人，学士，研究员，主要从事医学微生物、免疫制剂及保健食品研究。

于丽萍（1962-），女，黑龙江大庆人，学士，高级工程师，主要从事微生物研究及管理工作。