外周血CD4+T细胞组蛋白乙酰化在狼疮性肾炎中的作用*

刘抗寒,刘 芳,梁玉梅,饶 慧,陈 莹,曾清华

(湖南省人民医院肾脏风湿免疫科,长沙 410005)

论著·基础研究

外周血CD4+T细胞组蛋白乙酰化在狼疮性肾炎中的作用*

刘抗寒,刘 芳,梁玉梅△,饶 慧,陈 莹,曾清华

(湖南省人民医院肾脏风湿免疫科,长沙 410005)

目的研究狼疮性肾炎(LN)患者外周血CD4+T细胞组蛋白乙酰化水平，探究其在LN发病中的作用。方法18例LN患者均来自该科病房，全部患者都达到美国风湿学会1997年推荐的系统性红斑狼疮(SLE)的分类诊断标准。满足以下条件为活动性的LN，蛋白尿大于0.5 g/d，或活动性尿沉渣改变(血尿红细胞超过5个/Hp，或脓尿白细胞大于5个/Hp，或细胞管型大于1个/Hp)，血肌酐升高大于1.2 mg/L，排除感染、肾结石和其他原因引起的。非活动的LN:蛋白尿小于0.5 g/L，非活动性的尿沉渣。将LN患者分为两组:非活动性(I组)8例、活动性的LN组(A组)10例，对照组(N组)8例。分别采集LN患者和N组的外周血50 mL，密度梯度离心法(Ficoll法)分离出外周血中的单个核细胞，采用免疫磁珠技术分选出CD4+T细胞，并提取组蛋白，采用组蛋白H3/H4乙酰化检测试剂盒检测组蛋白H3/H4的乙酰化水平，分析组蛋白H3/H4乙酰化水平及与疾病的关系。结果(1)与N组相比，A和I组LN患者外周血CD4+T细胞的组蛋白H3、H4均呈低乙酰化状态(P<0.01)；(2)A组的组蛋白H4的乙酰化水平低于I组(P<0.01)，而组蛋白H3乙酰化水平两组间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)组蛋白H4的乙酰化水平与24 h尿蛋白排泄量呈负相关(r=-0.661，P<0.05)。结论在LN患者中的CD4+T细胞组蛋白H3和组蛋白H4均呈低乙酰化状态可能参与了LN的发病， CD4+T细胞组蛋白H4的乙酰化水平可能与LN的活动性有关。

组蛋白类；乙酰化作用；狼疮肾炎；蛋白尿

狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)是系统性红斑狼疮(SLE)常见并发症，也是导致SLE患者死亡的主要原因[1]。CD4+T细胞具有调控、辅助免疫应答作用，对CD8+T细胞的激活和增殖发挥辅助作用，在SLE发病中发挥了重要作用[2]。近年来，表观遗传学是SLE发病机制研究热点，组蛋白乙酰化修饰参与了SLE的发病。本研究旨在研究LN患者中外周血CD4+T细胞组蛋白乙酰化水平，探究其在LN发病中可能的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 18例LN患者均来自本科病房，全部患者都达到美国风湿学会(American college of rheumatology,ACR)1997年推荐的SLE的分类诊断标准。参照文献对LN的分类标准[3-5]，满足以下条件为活动性的LN，蛋白尿大于0.5 g/d，或活动性尿沉渣改变(血尿红细胞大于5个/Hp，或脓尿白细胞大于5个/Hp，或细胞管型大于1个/Hp)，血肌酐升高大于1.2 mg/L，并排除感染、肾结石和其他原因引起的。非活动的LN:蛋白尿小于0.5 g/L,非活动性的尿沉渣。将LN患者分为两组，非活动性的LN组(inactive group， I组)，患者10例，活动性的LN组(active group，A组)，患者8例。对照组(normal group，N组)8例，均来自本院的健康医务人员。组间的性别、年龄均差异无统计学意义。LN患者和N组的一般资料见表1。

表1 LN患者和N组的一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 分离外周血中的单个核细胞 抽取18例LN患者和8例对照组外周血50 mL，使用密度梯度离心法来分离50 mL外周血中的单个核细胞。

1.2.2 免疫磁珠技术纯化分离单个核细胞中的CD4+T淋巴细胞 (1)接着上面分离单个核细胞的步骤弃上清液之后，用移液枪吸取PBS 1 000 μL打匀细胞，将混匀后的液体移入一个干净的新的50 mL离心管中，再用相同的方法继续用PBS洗细胞，清洗3次之后，全部都收集到50 mL的离心管中，之后再加满PBS；(2)在4 ℃、2 000 r/min离心10 min，弃上清液后，在避光条件下加入新鲜的buffer溶液320 μL(10 mL血液加入80 μL buffer 溶液)，充分混匀后，加入CD4+T细胞磁珠(Miltenyi公司，德国)80 μL(10 mL血液加入20 μL buffer 溶液)，充分混匀，在4 ℃的冰箱中避光条件下孵育15 min；(3)孵育之后取出离心管后，加入buffer溶液至总容量达15～20 mL；(4)在4 ℃、320×g离心10 min，弃上清液，将分选CD4+T细胞的磁柱放在磁力架上，同时用移液枪吸取3 mL的buffer溶液润湿磁柱，下接干净的新的50 mL的离心管；(5)在弃上清的离心管中加入600 μL的buffer溶液，吹打混匀后转入柱中过磁；(6)待滴尽后将3 mL的buffer溶液加入离心管中，充分洗净混匀后再次转入柱中过磁，并反复重复2次，为了尽量减少丢失离心管中的单个核细胞；(7)全部滴尽后取下磁珠置于一支新的15 mL的离心管，加入5 mL的buffer溶液于磁珠中，快速加压打尽，新的15 mL离心管中的溶液即为CD4+T细胞，原来离心管中的事杂细胞；(8)将收集的5 mL的CD4+T细胞均匀分装到3个新的Ep管中，在离心机中2 500 r/min中离心3 min，弃上清液后再次离心2 500 r/min 1 min，以便完全弃掉buffer溶液，用移液枪吸取多余的水分，防止细胞降解；(9)将离心后的Ep管放入-80 ℃的冰箱中保存，为下一步的提取组蛋白做准备。

1.2.3 提取组蛋白 按照EpiQuikTMtotal histone extraction kit试剂盒的说明书提取CD4+T细胞组蛋白。

1.2.4 检测组蛋白H3和组蛋白H4乙酰化 采用EpiQuikTMtotal histone H3 Acetylation Detection Fast Kit (Colorimetric)试剂盒检测组蛋白H3的乙酰化，EpiQuikTMtotal histone H4 Acetylation Detection Fast Kit (Colorimetric)检测组蛋白H4乙酰化，采用酶标仪在450 nm处读取吸光值(OD值)；计算组蛋白H3、H4乙酰化:组蛋白H3(H4)乙酰化%=OD(样本组-空白对照组)/OD(标准对照组-空白对照组)×100%。

2 结 果

2.1 LN患者外周血CD4+T细胞组蛋白H3和组蛋白H4乙酰化水平的比较 与N组相比，I组和A组LN患者外周血CD4+T细胞组蛋白H3均呈低乙酰化状态(P<0.01)；与I组比较，A组LN患者外周血CD4+T细胞组蛋白H3乙酰化程度降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2，图1。与N组相比，I组和A组LN患者外周血CD4+T细胞组蛋白H4均呈低乙酰化状态(P<0.01)；A组LN患者组蛋白H4的乙酰化水平比I组患者的明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组外周血CD4+T细胞组蛋白H3、H4乙酰化的程度

图1 3组蛋白乙酰化水平比较

图2 CD4+T细胞组蛋白H4乙酰化水平与24 h尿蛋白排泄的相关性分析

2.2 LN患者外周血CD4+T细胞组蛋白H3、H4乙酰化的水平与24 h尿蛋白排泄量的相关性分析 LN患者外周血CD4+T细胞组蛋白H4乙酰化水平与24 h尿蛋白排泄量呈负相关(r=-0.661，P<0.01)，见图2。

3 讨 论

LN是SLE的最常见和严重的并发症，是SLE患者死亡的常见病因[1]。SLE是患者体内内源性的B淋巴细胞过度活化，导致产生大量的抗体，尤其是针对自身机体的DNA、RNA及与他们结合的蛋白产生抗体，而这个过程是在T细胞介导下产生的适应性的免疫应答过程。目前研究发现，CD4+T细胞在SLE的发病过程中起主导作用[2,6-7]。

组蛋白的修饰方式在SLE疾病的发生、发展过程中起很重要的作用[8-10]。Mishra等[11]给MRL-lpr/lpr 小鼠注射组蛋白去乙酰化酶抑制剂(如TSA和SAHA)，导致细胞中的组蛋白H3和组蛋白H4的乙酰化的累积增加，从而下调脾细胞中的IL-12、IFN-γ、IL-6和IL-10的mRNA和蛋白质的水平，进而影响了基因转录，而MRL-lpr/lpr小鼠的临床表现明显减轻，如蛋白尿的量减少、肾小球肾炎症状缓解和脾脏的体积减轻等方面。Garcia等[12]给狼疮小鼠注射HDI(组蛋白去乙酰化酶抑制剂，TSA)，发现可以控制狼疮的活动性，蛋白尿和免疫复合物在肾小球中的沉积减少，脾脏的重量减轻。Reilly等[13]的实验也证实了在狼疮小鼠体内注射HDI(ITF2357，10 mg/kg)注射可以减轻肾脏疾病症状和减少炎症因子，这主要是通过改变T细胞的亚型和T细胞的乙酰化来减轻疾病的临床症状。Zhou等[14]在研究SLE患者中也发现，患者CD4+细胞存在组蛋白低乙酰化状态。

本研究观察了16例LN患者，采用免疫磁珠分选高纯度的CD4+T细胞，提取组蛋白后，检测组蛋白的乙酰化程度。结果发现，LN患者的CD4+T细胞中的组蛋白H3和组蛋白H4呈低乙酰化状态，提示LN患者CD4+T细胞中同样存在组蛋白的低乙酰化状态。活动性LN患者的组蛋白H4乙酰化明显低于非活动性的LN患者；同时，组蛋白H4乙酰化程度与24 h尿蛋白排泄量成负相关，提示CD4+T细胞乙酰化状态可能与LN活动性、尿蛋白排泄量有关。结合既往动物实验研究结果，干预CD4+T细胞组蛋白H4乙酰化水平可能可以诱导LN患者缓解。然而与既往研究不同的是，本研究中发现CD4+T细胞中的组蛋白H3的乙酰化水平有所降低，但与LN的活动性无关，推测可能存在以下几种可能:(1)本研究中LN的活动性标准与其他研究中采用的SLEDAI评分不一致，导致结果有区别；(2)LN患者CD4+T细胞中的组蛋白H3的乙酰化水平与SLE无肾脏受累的患者本身存在区别；(3)样本量较小，存在研究偏倚。

本研究存在的不足:仅观察了LN患者CD4+T细胞乙酰化的水平，未检测血浆中HAT和HDAC等活性，由于目前研究处于初步阶段，不能进行体内干预实验。CD4+T细胞乙酰化与LN的关系有待进一步的实验研究。

[1]Zubair A,Frieri M.Lupus nephritis:review of the literature[J].Curr Allergy Asthma Rep,2013,13(6):580-586.

[2]Ooi JD,Kitching AR.CD4+Th1 cells are effectors in lupus nephritis——but what are their targets?[J].Kidney Int,2012,82(9):947-949.

[3]Bernstein KA,Kahl LE,Balow JE,et al.Serologic markers of lupus nephritis in patients:use of a tissue-based ELISA and evidence for immunopathogenic heterogeneity[J].Clin Exp Immunol,1994,98(1):60-65.

[4]Feng X,Wu H,Grossman JM,et al.Association of increased interferon-inducible gene expression with disease activity and lupus nephritis in patients with systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,2006,54(9):2951-2962.

[5]Wagner SJ,Craici I,Reed D,et al.Maternal and foetal outcomes in pregnant patients with active lupus nephritis[J].Lupus,2009,18(4):342-347.

[6]Zhang YQ,Zhao M,Sawalha AH,et al.Impaired DNA methylation and its mechanisms in CD4(+)T cells of systemic lupus erythematosus[J].J Autoimmun,2013(41):92-99.

[7]Suen JL,Chiang BL.CD4(+)FoxP3(+) regulatory T-cells in human systemic lupus erythematosus[J].J Form Med Assoc,2012,111(9):465-470.

[8]Gay S,Wilson AG.The emerging role of epigenetics in rheumatic diseases[J].Rheumatology(Oxford),2014,53(3):406-414.

[9]Javierre BM,Richardson B.A new epigenetic challenge:systemic lupus erythematosus[J].Adv Exp Med Biol,2011(711):117-136.

[10]Patel DR,Richardson BC.Epigenetic mechanisms in lupus[J].Curr Opin Rheumatol,2010,22(5):478-482.

[11]Mishra N,Reilly CM,Brown DR,et al.Histone deacetylase inhibitors modulate renal disease in the MRL-lpr/lpr mouse[J].J Clin Invest,2003,111(4):539-552.

[12]Garcia BA,Busby SA,Shabanowitz J,et al.Resetting the epigenetic histone code in the MRL-lpr/lpr mouse model of lupus by histone deacetylase inhibition[J].J Proteome Res,2005,4(6):2032-2042.

[13]Reilly CM,Regna N,Mishra N.HDAC inhibition in lupus models[J].Mol Med,2011,17(5/6):417-425.

[14]Zhou Y,Qiu X,Luo Y,et al.Histone modifications and methyl-CpG-binding domain protein levels at the TNFSF7 (CD70) promoter in SLE CD4+T cells[J].Lupus,2011,20(13):1365-1371.

The histone acetylation of CD4+T cells of peripheral blood in the lupus nephritis*

LiuKanghan,LiuFang,LiangYumei△,RaoHui,ChenYing,ZengQinghua

(DepartmentofNephrologyandRheumatology,HunanProvicialPeople′sHospital,Changsha,Hunan410005,China.)

Objective To study the histone acetylation level of CD4+T cells in peripheral blood of lupus nephritis,to explore the role of histone acetylation in pathogenesis of lupus nephritis.MethodsAccording to Feng X,Bernstein,Wagner S J and other scholars′s classification criteria for LN,those who met the following conditions considered for the activity of LN:proteinuria >0.5 g/d,change or activity of urinary sediment (hematuria > 5 red blood cell / Hp,or pyuria > 5 Hp white blood cells,or 1 cell type /Hp),serum creatinine increased >1.2 mg/L,and the exclusion of infection,kidney stones and other causes.Lupus nephritis patients were divided into inactive group (group I) 8 people,active group (group A) 10 people.18 patients with LN and 8 normal controls were collected peripheral blood 50 mL,density gradient centrifugation method (Ficoll method) for separation of mononuclear cells in peripheral blood;CD4+T cell was analyzed by immunomagnetic beads,extracted histone acetylation level and detected H3/H4 protein by the acetylation of histone H3/H4 kits and the relationship of histone H3/H4 acetylation with diseases was analyzed.ResultsFirst,compared with group N,the histone H3 and H4 of CD4+T cells in peripheral blood both in A and I of group LN patients showed low acetylation status (P<0.01);Second,the acetylation level of histone H4 in group A was lower than that in group I (P<0.01),histione H3 acetyl the level of the group of two groups had no statistical significant (P>0.05).Third,it was negatively related to the acetylation level of histone H4 and 24 h urinary protein excretion(r=-0.661,P<0.05).ConclusionHistone H3 and histone H4 of the CD4+T cells showed low acetylation may be involved in the pathogenesis of lupus nephritis.The acetylation level of histone H4 in CD4+T cells may be related to the activity of the LN.

histones;acetylation;lupus nephritis;proteinuria

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.006

湖南省人民医院仁术青年基金资助(2011-7)。

:刘抗寒(1979-)，博士，主治医生，主要从事慢性肾功能不全的防治。△

，Tel:13574895959；E-mail:liangyumei@aliyun.com。

R593.24+2

A

1671-8348(2015)30-4193-03

2015-04-23

2015-06-30)