不同粒径TiO2颗粒对海洋微藻的毒性效应

马菲菲，孙雪梅，韩倩，陈碧鹃，夏斌*，曲克明

(1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 山东省渔业资源与生态环境重点实验室，山东 青岛 266071)

不同粒径TiO2颗粒对海洋微藻的毒性效应

马菲菲1，孙雪梅1，韩倩1，陈碧鹃1，夏斌1*，曲克明1

(1.中国水产科学研究院 黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 山东省渔业资源与生态环境重点实验室，山东 青岛 266071)

本实验以新月菱形藻为受试生物，研究了低浓度不同粒径TiO2颗粒(21 nm、60 nm和400 nm)对海洋微藻生长、抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和过氧化物酶POD)、脂质过氧化产物(MDA)含量的影响，并测定了相应的活性氧自由基(ROS)的含量，初步探讨了TiO2颗粒对海洋微藻的作用机制。结果表明，1 mg/L TiO2颗粒对新月菱形藻生长的抑制作用随着粒径的减小而逐渐增强，第48 h、72 h、96 h呈现出显著的纳米效应。TiO2颗粒可以诱导藻细胞内ROS的含量增加，对藻细胞产生氧化胁迫，新月菱形藻的抗氧化酶活性发生应激响应，以清除过量的ROS，但剩余的ROS对藻细胞产生氧化损伤，导致MDA含量升高，并且纳米级TiO2颗粒对新月菱形藻的氧化损伤大于微米级颗粒。在不同粒径TiO2颗粒的胁迫下，藻细胞SOD和CAT活性的响应也存在差异。本研究将为开展人工纳米材料对海洋生态系统影响的潜在风险评估提供科学依据。

TiO2；新月菱形藻；纳米颗粒；海洋微藻；抗氧化酶；毒性效应

1 引言

随着纳米科技的迅猛发展，纳米材料已经广泛的应用在人类生产和生活中，同时也会不可避免的进入到水环境中，对水生生态结构和功能产生潜在的影响，已引起国内外科研工作者的广泛关注[1—2]。纳米TiO2已被工业化生产并大量的应用在水质净化、医药、化妆品、食品、电子及工程制造等领域[3—5]。微藻是水生生态系统的初级生产者，能为其他营养级的生物提供能量和氧气，对维护整个水生生态系统的物质平衡和能量循环起着十分重要的作用。因此，藻类毒性试验被广泛应用于评估有害物质的毒性效应[6—7]。目前国内外已有不少关于TiO2纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)对微藻毒性效应的报道[8—12]，均表明TiO2NPs可以抑制浮游植物的生长，并对藻细胞造成氧化损伤。但是以上研究都是针对TiO2NPs对淡水微藻的影响，而不同粒径TiO2颗粒对海洋微藻毒性效应的研究还未见报道。

NPs通过地表径流，大气沉降或人为泄漏等方式进入到海洋环境后，会受到海水有机质、离子强度和pH等水化学条件，光照、风浪等环境因素的影响而发生一系列复杂的聚集-分散-再聚集或者分散-聚集-再分散过程[13]，所以NPs在海洋环境中的行为相比与淡水中会更加复杂，进而会影响到NPs对海洋生物的毒性效应及致毒机制[14—15]。新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)是一种海洋真核单细胞硅藻，因其富含蛋白质、碳水化合物及多不饱和脂肪酸而被作为优良饵料广泛应用于水产养殖，是多种软体动物、甲壳类幼体和浮游动物的主要饵料。本研究选取3种不同粒径TiO2颗粒(21 nm、60 nm和400 nm)，分析TiO2颗粒对新月菱形藻生长、抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的影响以及相应的胞内活性氧自由基(ROS)含量的变化，探讨不同粒径TiO2颗粒对海洋微藻的毒性效应，为客观评价人工纳米材料对海洋生态系统的潜在影响提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

新月菱形藻取自中国水产科学研究院黄海水产研究所藻种培养室。21 nm TiO2颗粒购自西格玛奥德里奇(中国)有限公司，纯度大于99.5%；60 nm和400 nm TiO2颗粒购自阿拉丁试剂(中国)有限公司，纯度分别为大于99.8%和大于99.8%。本实验所用试剂均为国产优级纯或分析纯。玻璃器皿在使用前均用10%浓硝酸浸泡48 h，并用蒸馏水冲洗干净，高温高压(120℃，20 min)灭菌后待用。

2.2 实验方法

2.2.1 新月菱形藻的培养

将砂滤海水用0.45 μm混合纤维滤膜过滤后，置于锥形瓶中进行高温高压灭菌，添加f/2[16]培养液后，接入新月菱形藻，放入光照培养箱进行培养。培养温度为(20±0.5)℃，光照强度为3 500 lx，光暗比为12 h∶12 h。

2.2.2 TiO2母液的制备

将TiO2颗粒加入到f/2培养液中，制备浓度为1 000 mg/L的TiO2母液，置于棕色玻璃瓶中，待用。配制试验液之前超声波震荡30 min。

2.2.3 TiO2颗粒对新月菱形藻生长的影响

取生长状况良好，处于对数增长期的新月菱形藻加入到f/2培养基中，使得新月菱形藻密度为1×106cell/mL。把混合好的藻液分装到250 mL的锥形瓶中，每瓶体积为200 mL，分别将21 nm、60 nm和400 nm TiO2母液加入到藻液中，立即摇匀，配置浓度为1 mg/L TiO2实验组，每个实验组设3个平行，以正常培养的藻液(无TiO2)为对照组，然后放入光照振荡培养箱中培养。于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h在奥林巴斯显微镜(AX70)下用血球计数板计数得到藻细胞密度，以表征不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻生长的影响。

2.2.4 TiO2颗粒对新月菱形藻生理指标的影响

将新月菱形藻暴露在浓度为1 mg/L的21 nm、60 nm和400 nm TiO2实验组96 h后，运用高速冷冻离心机离心(5 000 r/min，5 min)收集100 mL的藻细胞，加入2 mL新鲜培养液使藻细胞悬浮，将收集到的藻细胞用超声破碎仪进行破碎，4 000 r/min离心5 min取上清液，用于 SOD，CAT，POD活性以及MDA和ROS含量的测定，均采用南京建成科技有限公司的试剂盒完成，具体操作参照说明书进行。其中，蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定；SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，定义每mg蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U/mg)；CAT活性采用紫外吸收法测定，定义为每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的过氧化氢的量为一个活力单位(U/m)；POD活性的测定采用催化过氧化氢反应的原理，在420 nm处测定吸光度的变化，定义在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1 μg底物的酶量为一个POD活力单位(U/mg)；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，单位为nmol/mg；在激发波长485 nm，发射波长538 nm，采用荧光分光光度计检测ROS含量，结果以荧光强度/mg表示。

2.3 数据处理

每个实验重复3次，数据结果以平均值±标准偏差表示，采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)，用Tukey’s test进行各组均数的多重比较，P<0.05表示显著差异。

3 结果与讨论

3.1 TiO2颗粒对新月菱形藻生长的影响

不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻生长的影响如图1所示。第24 h时21 nm、60 nm和400 nm TiO2颗粒对新月菱形藻生长出现抑制作用，到48 h时达到最大，抑制率分别为23.88%、21.66%和7.19%，随着暴露时间的延长，抑制率有所降低，到96 h时，抑制率分别为13.89%、12.68%和5.48%。第24 h时3种粒径TiO2颗粒对新月菱形藻的抑制作用没有显著差异(P>0.05)，随后21 nm与60 nm TiO2颗粒对新月菱形藻的抑制作用没有显著差异(P>0.05)，但与400 nm TiO2颗粒均具有显著差异(P<0.05)，这表明在纳米尺度范围内(1～100 nm)，1 mg/L的TiO2颗粒对新月菱形藻的抑制作用不具有尺寸效应，但是纳米级与微米级颗粒相比具有尺寸效应。Aruoja等[8]研究了大颗粒和纳米级CuO、ZnO及TiO2对羊角月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)生长的影响，结果表明大颗粒对微藻的72 h EC50值均显著大于纳米颗粒。Sadiq等[9]研究表明微米级TiO2颗粒对栅藻(Scenedesmussp.)和小球藻(Chlorellasp.)生长的抑制作用要小于纳米颗粒。以上研究是不同粒径颗粒对淡水微藻生长的抑制作用，但与本实验结果一致，均表现出良好的纳米效应，这表明虽然纳米颗粒在海水中发生团聚[17]，但仍有部分颗粒以纳米形式存在，从而对海洋微藻产生毒性效应。

图1 不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻生长的影响Fig.1 The impact of TiO2 particles on N.closterium cell growth 不同字母表示不同实验组间呈显著差异(P<0.05)，下同Different letters indicate significant differences among different treatments (P<0.05). The same below

3.2 TiO2颗粒对新月菱形藻的ROS含量的影响

当细胞受到外界毒物的干扰时，细胞就会处于氧化胁迫状态使得胞内ROS升高。在正常条件下，细胞内产生的ROS会被细胞的抗氧化还原系统清除掉，而如果细胞内产生的 ROS过多超出细胞的清除能力时，大量的ROS就会在细胞内累积从而引起细胞的氧化损伤，发生脂质过氧化、基因损伤及细胞凋亡等[18]。

不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻活性氧自由基(ROS)的影响如图2所示，新月菱形藻在1 mg/L TiO2颗粒的作用下产生大量的ROS，与对照组有显著性差异(P<0.05)，21 nm和60 nm TiO2颗粒与400 nm TiO2颗粒实验组相比具有显著差异(P<0.05)，这表明纳米级和微米级TiO2颗粒对新月菱形藻细胞ROS的影响具有显著的尺寸效应。细胞内ROS水平的增加，是对环境压力的一个早期响应[19]。已有研究证明，在纳米TiO2颗粒的作用下，大肠杆菌(Escherichiacoli)[20]、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)[21]、短裸甲藻(Gymnodiniumbreve)[11]均产生大量ROS，与对照组呈显著差异(P<0.05)，与本实验结果一致。所以，ROS是纳米颗粒对细胞产生氧化损伤的主导因素，而纳米颗粒的氧化损伤机制是迄今最为普遍接受的一种纳米材料致毒机制[22]。

图2 TiO2颗粒对新月菱形藻ROS的影响Fig.2 ROS level of algal cells after exposed to TiO2particles for 96 h

3.3 TiO2颗粒对新月菱形藻丙二醛(MDA)含量的影响

丙二醛(MDA)是膜脂受活性氧作用产生的物质，测定其含量可以评价质膜受损程度，反映植物遭受逆境伤害的程度。MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可以对膜和细胞造成一定的伤害。

不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻MDA含量的影响如图3所示，1 mg/L TiO2颗粒处理新月菱形藻后，各实验组藻细胞MDA含量均增加，其中21 nm和60 nm TiO2颗粒实验组与对照相比增加了近1倍，具有显著差异(P<0.05)。400 nm TiO2颗粒实验组与对照组，21 nm和60 nm TiO2颗粒实验组均无显著差异(P>0.05)。在纳米TiO2颗粒(21 nm和60 nm)暴露下，藻细胞ROS和MDA含量变化趋势基本一致，也进一步证实藻中ROS的增多导致细胞脂质过氧化产物MDA的累积，从而使得细胞发生脂质过氧化。侯东颖等研究表明在1 mg/L纳米TiO2颗粒暴露下，普生轮藻(Charavulgaris)的MDA含量显著升高，造成了膜脂质过氧化，与本实验结果一致[12]。在微米TiO2颗粒暴露下，藻细胞ROS含量虽然显著高于对照组，但藻细胞MDA含量与对照组没有显著差异，这主要是由于藻细胞内抗氧化酶活性对胁迫发生响应，清除了一部分ROS，剩余的ROS没有对藻细胞产生脂质过氧化。

图3 TiO2颗粒对新月菱形藻MDA含量的影响Fig.3 MDA levels of algal cells after exposed to TiO2 particles

3.4 TiO2颗粒对新月菱形藻抗氧化酶活性的影响

综上所述，低浓度TiO2颗粒进入海水中发生团聚[17]，但仍有部分颗粒以纳米形式存在，对新月菱形藻生长的抑制作用以及氧化损伤均呈现出纳米效应。在不同粒径TiO2颗粒暴露下，海洋微藻细胞发生应激响应，SOD和CAT活性受到显著诱导或抑制，以清除过量的ROS，从而减轻藻细胞的氧化损伤。由于暴露TiO2颗粒粒径的不同，藻细胞抗氧化酶活性响应存在差异，这可能是由于不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻的作用方式有所不同，这将是我们下一步研究的重点，以明确不同粒径TiO2颗粒对海洋微藻的致毒机制。

4 结论

(1)浓度为1 mg/L的TiO2颗粒(21 nm、60 nm和400 nm)对新月菱形藻的生长均有抑制作用，并且在第48 h、72 h、96 h时纳米级和微米级颗粒对新月菱形藻生长的抑制作用具有显著差异，呈现出纳米效应。

(2)在TiO2颗粒的作用下，新月菱形藻ROS的含量增加，MDA的含量升高，且纳米级的TiO2颗粒(21 nm和60 nm)对新月菱形藻的氧化损伤要大于微米级(400 nm)。

(3)在不同粒径TiO2颗粒的胁迫下，新月菱形藻的SOD和CAT活性受到显著诱导或抑制，但响应存在差异，这可能是由于TiO2颗粒因粒径不同对海洋微藻的作用方式有所不同。

图4 不同粒径TiO2颗粒对新月菱形藻抗氧化酶活性的影响Fig.4 Antioxidant enzymes activities of algal cells after exposure to TiO2 particles

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Toxic effects of TiO2particles with different size on the marine microalga

Ma Feifei1，Sun Xuemei1，Han Qian1，Chen Bijuan1，Xia Bin1，Qu Keming1

(1.KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries，MinistryofAgriculture，ShandongProvincialKeyLaboratoryofFisheryResourcesandEcologicalEnvironment，YellowSeaFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Qingdao266071，China)

With the increasing application of nanotechnologies，it is no doubt that more and more engineered nanoparticles end up in marine environment. The toxicity of TiO2particles with different sizes (21 nm，60 nm and 400 nm) to the marine microalgaNitzschiaclosteriumwas investigated in this study，including the growth inhibition and oxidative stress. The results showed that the toxicity of 1 mg/L TiO2particles toN.closteriumcells increased with the decrease of particle size，indicating significant nano-effects at 48 h，72 h and 96h exposure，respectively. TiO2particles induced excessive reactive oxygen species (ROS) which led to oxidative stress on the algal cells. The antioxidant enzyme activities ofN.closteriumcells could eliminate some ROS in order to protect algae cells. However，the rest could cause oxidative damage and increase malondialdehyde (MDA) levels concomitantly. In addition，the oxidative damage caused by nano-sized TiO2particles (21nm and 60nm) was greater than micro-sized particles. Superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities of the algal cells had different response under the stress of TiO2particle with different size. This study shed new light on the assessment of ecological toxicity of engineered nanomaterials．

TiO2;Nitzschiaclosterium; nanoparticles; marine microalga; antioxidant enzyme; toxic effect

2015-01-05；

2015-07-21。

中国水产科学研究院基本科研业务费(2013A02YQ02)；国家自然科学青年基金(41206100)；中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费专项基金(20603022012020)。

马菲菲(1987-)，女，山西省运城市人，主要从事海洋生态毒理学研究。E-mail:wuyanmf001@163.com

*通信作者：夏斌，副研究员，主要从事海洋生态毒理学研究。E-mail：xiabin@ysfri.ac.cn

10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.010

X171.5

A

0253-4193(2015)10-0100-06

马菲菲，孙雪梅，韩倩，等. 不同粒径TiO2颗粒对海洋微藻的毒性效应[J].海洋学报，2015，37(10)：100—105，

Ma Feifei，Sun Xuemei，Han Qian，et al. Toxic effects of TiO2particles with different size on the marine microalga[J]. Haiyang Xuebao，2015，37(10)：100—105，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.10.010