银杏叶提取物中银杏内酯B分离纯化工艺研究

张武圣

（河南省中医院药学一部，郑州450002）

银杏叶提取物中银杏内酯B分离纯化工艺研究

张武圣

（河南省中医院药学一部，郑州450002）

目的建立一种较为简单的从银杏叶提取物（GBE）中分离纯化银杏内酯B（GB）单体的工艺方法o方法依次通过GB E热水溶解、乙酸乙酯萃取、结晶及重结晶方法对GB E中GB单体进行分离纯化o结果确定GB最佳分离纯化工艺为:将GB E用热水溶解，加入乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，萃取液用2%N aH C O3除杂，收集除杂后乙酸乙酯萃取液，减压浓缩至干，用50%乙醇回流溶解后静置析晶，抽滤后得到GB粗结晶，粗结晶用80%甲醇重结晶2次即得，该工艺制备得到的GB单体纯度≥98%，总收率约为60%o结论该工艺稳定、简便易行，适合工业化大生产o

银杏内酯B；提取；分离；纯化；中药化学

目前，从银杏叶中已分离得到8个萜内酯化合物银杏内酯(ginkgolide)A，B，C，J，M，K，L和白果内酯(bilobalide)［1-2］o研究发现它们是很强的血小管活化因子(PAF)拮抗剂，具有治疗休克、烧伤、过敏性哮喘等病症的一类新药［5］，以GB活性最强［3-4］，o目前在法国、英国等国家已经分别进入Ⅱ期和Ⅲ期临床，极具发展潜力o

然而银杏叶中银杏萜内酯的含量极低（0.001%～0.8%），银杏叶标准提取物中的总内酯含量也仅仅在6%左右［6］，要得到银杏萜内酯中具有较高药用价值的GB，必须将银杏叶或其粗提物进行进一步处理o目前文献报道的银杏内酯的提取纯化方法主要有：溶剂萃取法、柱柱分离法、溶剂萃取-柱分离法及超临界提取法［7-8］o本实验结合已有的各种分离纯化方法，拟建立适合于工业化生产的GB的富集纯化方法o

1 材料

1.1 药材与试剂银杏叶标准提取物（上海市信谊百路达药业有限公司，批号A-01-1191010），银杏内酯B对照品（中国食品药品检定研究院，批号110863-201409），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯

1.2 仪器Agilent 1100系列高效液相色谱仪（Agilent 1100色、谱泵，ELSD-2000ES蒸发光散射检测器，Agilent 1100色谱工作站），RE-200恒温升降水浴锅（巩义市予华仪器有限公司），RE-201旋转蒸发器浓缩仪（巩义市予华仪器有限公司）

2 方法与结果

2.1 提取工艺参数的优化

2.1.1 银杏叶提取物最佳稀释浓度考察分别精密称取银杏叶提取物浸膏4份，加水溶液10ml使浸膏浓度分别为0.1g/ml，0.2g/ml，0.3g/ml，0.4g/ml，分别加入乙酸乙酯进行萃取，共萃取五次，每次25ml，合并五次萃取液，45℃浓缩至干，备用o

分别精密称取上述4份样品，按照项1.4项下供试品制备方法制备样品，HPLC-ELSD法测定，计算，结果见表1o

表1 银杏叶提取物最佳稀释浓度考察

从结果上看，0.1g/ml药液浓度萃取效果较差，0.2g/ml与0.4g/ml药液萃取效果基本接近，考虑药液浓度较小，有利于后续萃取操作和清场的方便，因此选择0.2g/ml为最佳药液浓度o

2.1.2 正交试验考察萃取相关工艺参数

2.1.2.1 正交试验设计分别精密称取银杏叶提取物浸膏9份，每份50g，加水稀释至生药浓度为0.2g/ml作为试验样品，以萃取次数（次）、溶剂单次用量（W/V）、萃取时间（min）为考察因素，以GB萃取率为考察指标，按照L934正交试验表建立正交试验表，见表2，结果及方差分析见表3、表4o

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验结果

表4 方差分析结果

从结果看，A因素（乙酸乙酯单次用量）和C因素（萃取次数）有显著性差异，根据直观分析，A1＞A3＞A2，C2＞C3＞C1，因此选择A1和C2；B因素（萃取时间）无显著性差异，考虑缩短时间，因此选择B1，因此确定最佳液液萃取工艺为A1B1C2o

2.2 分离纯化工艺参数优化

2.2.1 结晶工艺参数的优化精密称定银杏叶提取物浸膏3份，每份50g，根据上述最佳萃取工艺进行萃取，分别浓缩至干，加入1倍浓缩物量30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，加热回流至完全溶解，4℃静置过夜析晶，抽滤，收集滤饼，即得o分别按项1.5和1.6方法进行样品制备及含量测定，结果见表5o

表5 结晶工艺参数优化结果

由结果可知，30%乙醇析出物为粘稠油状物，不利于进一步的重结晶；70%乙醇无法析晶GB粗结晶，因此最合适结晶溶剂为1倍干固物量的50%乙醇o

2.2.2 第一步重结晶工艺参数的优化精密称取银杏叶提取物300g，根据上述确定的萃取及结晶最佳工艺进行萃取分离，得到GB粗结晶9.26g（纯度62.8%），均分为3份，分别加入70%乙醇、80%甲醇及异丙醇，加入最少溶剂量回流加热溶解后，4℃静置过夜析晶，抽滤，收集滤饼，即得o分别按项1.5和1.6方法进行样品制备及含量测定，结果见表6o

表6 重结晶工艺参数优化结果

由结果可知，异丙醇未析出晶体；80%甲醇重结晶后所得GB纯度明显高于70%乙醇，且GB收率差别不大，因此选择80%甲醇作为GB重结晶溶剂o

2.3 验证试验分别精密称取银杏叶提取物浸膏3份，每份500g，按上述确定的萃取精制工艺进行试验，所得GB单体按照按项1.5和1.6方法进行样品制备及含量测定，试验结果见表8o

表8 验证试验结果

3 讨论

通过以上研究，确定从银杏叶提取物浸膏中提取、分离、纯化GB的最佳工艺为：银杏叶提取物加水稀释至0.2g生药/ml，加入2倍浸膏重的乙酸乙酯萃取4次，每次萃取5min，合并萃取液，减压浓缩至干，加入1倍浓缩物重的50%乙醇回流至完全溶解，4℃静置过夜析晶，抽滤，滤饼加入30倍重量的80%甲醇重结晶，回流至完全溶解，4℃静置过夜析晶，抽滤，滤饼继续加入25倍重量的80%甲醇，回流至完全溶解，4℃静置过夜析晶，抽滤，结晶于80℃减压干燥，即得o

本实验利用银杏内酯成分在乙酸乙酯中具有较高的溶解度，利用有机溶剂萃取-结晶方法分离纯化其中的GB单体，从而得到纯化较高的GB，具有操作简单、工艺稳定、结果可靠的优点，适用于工艺生产o

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ZHANG Wusheng
(Department of Pharmacy， Henan Province Hospital of TCM， Zhengzhou 450002， China）

ObjectiveTo establish the simplE Technology of the separation and purifyicatioN Of ginkalide B from ginkgo biloba extract.MethodsThe ginkgo biloba extract was dissolved in hot water，then it was extracted by ethyl acetate，in the end，the ginkgolide B was obtained by crystal and recrystal.ResultsThe best technology of the separation and purification process of GB ginkgo was as follows:the biloba extract was dissolved in hot water，then extracted 3 times by ethyl acetate，extract liquoredulcoration by 2% dicarbonate，the liquorvacuum concen-tration to dry，then the distillate dissolved by 50% ethyl alcohol to crystallize，suction filtration，the coarse crystallization crystallizes and recrystallizes by 80% methyl alcohol.The purity of the ginkgolide B obtained by this methods was equal or greater than 98%，and the yields was about 60%.ConclusionThis technology is stabilization and convenience，and is suitable for industrialized production.

Ginkalide B;extraction;separation;purification;chemistry of Chinese materia medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.23.070

1672-2779（2015）-23-0136-03

：张文娟本文校对：黄小敏

2015-08-31）