百尾参药材高效液相色谱指纹图谱分析*

甘秀海，梁志远，周欣，赵超，卫钢

(1.贵州师范学院化学与生命科学学院，贵阳 550018；2.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001；3.澳大利亚联邦科学与工业研究组织材料科学与工程分部，新南威尔士 2070)

·药物制剂与药品质量控制·

百尾参药材高效液相色谱指纹图谱分析*

甘秀海1，梁志远1，周欣2，赵超2，卫钢3

(1.贵州师范学院化学与生命科学学院，贵阳 550018；2.贵州师范大学天然药物质量控制研究中心，贵阳 550001；3.澳大利亚联邦科学与工业研究组织材料科学与工程分部，新南威尔士 2070)

目的建立百尾参药材的高效液相色谱指纹图谱。方法采用高效液相色谱法，以Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以甲醇-0.05%磷酸为流动相，梯度洗脱，流速为1 mL·min-1，检测波长256 nm，柱温为30 ℃。结果建立了15批不同产地的百尾参药材指纹图谱，共标定13个分离度较好的共有峰，利用对照品指认4个共有峰；用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行化学模式识别研究。结论该方法简便、准确、重复性好，可作为百尾参药材质量控制的手段。

百尾参；色谱法，高效液相；指纹图谱；相似度；聚类分析

百尾参为百合科Liliaceae万寿竹属植物万寿竹(Disporumcantoniense(Lour.)Merr.)。其味甘、淡，性平，具有祛风湿、舒筋活血、清热祛痰止咳的功效[1]。百尾参为贵州省特色药用植物，是苗族习用药材，主要以根入药，民间广泛应用于祛痰止咳，也是百灵药业咳速停系列止咳药物中的主药材之一，该药在医院临床应用较广泛。目前关于百尾参化学成分及生物活性研究有相关的报道[2-5]，其中含有酰胺、黄酮及甾体类化合物，但未见其质量控制研究方面的报道。由文献可知酰胺类化合物钝叶扁柏氨基甲酸酯A(obtucarbamate A，CAS：6935-99-5)、钝叶扁柏氨基甲酸酯B(obtucarbamate B，CAS：20913-18-2)具有明显的止咳活性；另外槲皮素、大黄素具有较好抗菌活性。因此，为了评价不同产地百尾参药材的品质，保障咳速停系列止咳药物的内在质量，笔者在本实验中采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)以obtucarbamate A、obtucarbamate B、槲皮素和大黄素为对照品对百尾参药材指纹图谱进行研究[6]，并通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算不同产地百尾参药材的相似度，采用聚类分析和主成分分析对指纹图谱进行化学模式识别研究，为建立百尾参药材的质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex-Ultimate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司，四元泵，自动进样器，多薄层紫外检测器，柱温箱)；DZF-6020型真空干燥箱(杭州蓝天化验仪器厂)；DFY-200型高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg)；HH-6型电热恒温水浴锅(金坛市荣华仪器制造有限公司)；EM-202 MS1型微波真空干燥机(合肥荣事达三洋电器股份有限责任公司)。

1.2 试药 15批百尾参样品信息见表1，经贵州师范学院化学与生命科学学院朱富寿教授鉴定为百尾参(Disporumcantoniense)的根茎；obtucarbamate A、obtucarbamate B、槲皮素、大黄素对照品，本课题组自制，纯度均>99%(HPLC归一化法测定)；流动相甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

表1 百尾参样品来源

Tab.1 Sources ofDisporumcantoniensesamples

样品产地采集时间S1贵州思南2012年9月S2贵州贵阳乌当2012年10月S3贵州安顺2012年8月S4贵州独山2012年8月S5贵州关岭2012年10月S6贵州贵定2012年9月S7贵州贵阳花溪2012年8月S8贵州凯里2012年10月样品产地采集时间S9贵州雷山2012年8月S10贵州龙里2012年9月S11贵州盘县2012年8月S12贵州习水2012年10月S13贵州玉屏2012年10月S14贵州织金2012年8月S15贵州遵义2012年9月

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇(A)-0.05%磷酸(B)为流动相，按表2中的梯度进行洗脱；检测波长256 nm；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1；供试品及对照品进样量10 μL；分析时间71 min。

表2 流动相梯度表 Tab.2 Gradient of mobile phase

2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取恒重后的obtucarbamate A 3.5 mg、obtucarbamate B 1.1 mg、槲皮素2.8 mg、大黄素1.2 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容并摇匀，即得对照品溶液，进样前过孔径0.45 μm滤膜，用以定位色谱峰位置。

2.3 供试品溶液的制备 取过筛孔内径0.425 mm筛的药材粉末2.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入80%乙醇40 mL，于80 ℃水浴回流提取2.0 h，滤过，浓缩，加水10 mL分配，再用乙酸乙酯每次15 mL萃取3次，合并有机相，挥干，用甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验 取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下方法连续进样6次，记录特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行评价，相似度均>0.95，符合特征图谱技术要求，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性实验 取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下方法在0，2，4，8，16，24 h分别进样测定，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行评价，相似度均>0.95，符合特征图谱技术要求，表明样品在24 h内稳定。

2.4.3 重复性实验 分别取S1样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对结果进行相似度分析，结果表明相似度均>0.95，说明方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立及评价

2.5.1 指纹图谱的建立及共有峰的标定 分别取S1～S15样品按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，记录色谱图。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004年A版)软件，以样品S1的色谱图为参照图谱，采用自动匹配法生成对照图谱R(图1)。分析各样品之间的共有峰并标定共有峰，结果确定了15批样品有13个分离度较好的共有峰(图2A)，通过与对照品色谱图(图2B)比较指认图谱中的5号峰为obtucarbamate B，保留时间为28.99 min，6号峰为obtucarbamate A，保留时间为34.92 min，8号峰为槲皮素，保留时间为38.31 min，13号峰为大黄素，保留时间为61.35 min。

2.5.2 相似度评价分析 将对照用指纹图谱及15批百尾参样品图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004年A版)软件，采用相关系数法对样品总色谱峰进行相似度评价，通过与共有模式比较，各样品色谱图相与对照图谱R的相似度结果见表3，除贵州贵定样品(S6)外，其余样品与对照图谱R的相似度均>0.9。以6号峰(obtucarbamate A)参照峰，设其相对保留时间和峰面积为1，计算各共有峰对它的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，15批百尾参共有峰相对保留时间的RSD较小，均<1.00%，但相对峰面积的RSD较大(32.08%～181.85%)，表明百尾参药材的主要成分相似，但各成分的含量差别较大，说明产地不同对药材中各成分的含量影响较大。见表4，5。

图1 15批百尾参药材HPLC指纹图谱

Fig.1 HPLC fingerprints for 15 batches ofDisporumcantoniensesamples

2.6 化学模式识别

2.6.1 聚类分析 利用SPSS17版数据统计软件，选取13个共有峰面积为变量，采用组间连接法，以欧氏距离平方和作为测度对样品聚类，结果如图3。由树状图中可以看出，15批样品聚为2类，S6聚为一类(B类)，其余样品聚为一类(A类)，与相似度分析结果相符。

2.6.2 主成分分析 各样品经分析得到色谱数据，通过相对保留时间定位，以对应的峰面积的积分值作为数据源，形成样本数据矩阵，采用SPSS 17版统计软件分析，以主成分PC1和PC2所组成的平面投影图见图4。由图4可知，样品S6更加接近PC2，单独列为一类；其他批次样品游离主体分布投影群，被视为一类。这一统计结果与聚类分析、相似度分析结果基本一致。

5.钝叶扁柏氨基甲酸酯B；6.钝叶扁柏氨基甲酸酯A；8.槲皮素；13.大黄素

图2 百尾参药材共有模式(A)及混合对照品(B)HPLC图谱

5.obtucarbamate B；6.obtucarbamate A；8.quercetin；13.emodin

Fig.2 HPLC chromatograms of common mode(A) and mixed reference(B) ofDisporumcantoniense

表3 样品特征图谱与共有特征图谱R的相似度

Tab.3 Similarity of characteristic peaks of samples and common characteristic peaks of R

样品相似度S10．967S20．923S30．904S40．977S50．918S60．547S70．957S80．977样品相似度S90．944S100．969S110．928S120．954S130．994S140．901S150．992

表4 百尾参特征图谱共有峰相对保留时间 Tab.4 Relative retention time of common peaks of characteristic chromatograms for Disporum cantoniense

表5 百尾参特征图谱共有峰相对峰面积 Tab.5 Relative peak areas of common peaks of characteristic chromatograms for Disporum cantoniense

图3 聚类分析树状图

3 讨论

3.1 供试品制备方法的优化 考虑到百尾参的化学成分，笔者在本实验中分别考察了不同溶媒、不同提取方法色谱图的差异，结果发现80%乙醇加热回流，经乙酸乙酯萃取后的供试品所得的色谱峰数目较多，分离度较好，因此优选80%乙醇加热回流再经乙酸乙酯萃取为供试品的前处理方法。

3.2 检测波长的选择 为了获得样品全面的色谱信息，笔者在本实验中分别对比较了波长210，230，256，

图4 主成分分析平面投影图

280，310，330，360 nm下的色谱图，结果发现210 和230 nm下的色谱图峰最多，但基线漂移；而280，310，330和360 nm下的色谱图峰较少，无法全面反映药材的成分；256 nm下的色谱图峰较多，分离度最好，固选择256 nm为样品的检测波长。

3.3 流动相的优化 为了得到分离度较好的色谱图，笔者在本实验中分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.2%乙酸等流动相系统进行等度和梯度洗脱对色谱峰的影响。结果显示以甲醇-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱，能得到分离度较好且峰型对称的色谱图。

3.4 指纹图谱评价与分析 由中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件分析结果可知，不同产地百尾参药材的主要成分相似，但各成分的含量差别较大，说明产地不同对药材中各成分的含量影响较大。其中贵州贵定的百尾参药材图谱与共有模式图谱比较相似度低于0.6，与其他产地冷水花药材相比具有明显的差异。

另外，从系统聚类分析和主成分分析2种化学计量学方法对百尾参色谱积分数据进行模式识别结果显示，两者判断结果基本一致，且与相似度分析结果类似。因此，将指纹图谱及相似度分析和模式识别结合起来进行中药材质量控制是一种行之有效的手段，有利于全面、准确地控制中药材质量。

[1] 贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003：162.

[2] CHEN L，SU Y F，YIN Z Y，et al.Flavonoids fromDisporumcantoniense(Liliaceae)[J].Biochem Syst Ecol，2009，37(5)：609-612.

[3] 陈磊.百合科两种药用植物化学成分及生物活性研究[D].天津：天津大学，2009：216-217.

[4] 甘秀海，周欣，梁志远，等.百尾参根的化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(23)：140-142.

[5] 甘秀海，赵超，梁志远，等.百尾参止咳活性成分研究[J].中国中药杂志，2013，38(23)：4099-4102.

[6] 周欣，陈华国，张明，等.刺梨高效液相色谱指纹图谱研究[J].医药导报，2014，33(1)：82-85.

HPLC Fingerprint Analysis of Disporum Cantoniense

GAN Xiuhai1, LIANG Zhiyuan1, ZHOU Xin2, ZHAO Chao2, WEI Gang3

(1.SchoolofChemistryandLifeScience,GuizhouNormalCollege,Guiyang550018,China； 2.ResearchCenterforQualityControlofNaturalMedicine,GuizhouNormalUniversity,Guiyang550001,China； 3.CSIROMaterialsScienceandEngineering,NSW2070,Australia)

Objective To establish the HPLC fingerprint ofDisporumcantoniense. Methods HPLC analysis was performed on Agilent Zorbax SB-C18chromatographic column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with the mobile phase consisting of methanol-0.05% phosphoric acid in gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was 256 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The HPLC fingerprint of 15 batches ofDisporumcantoniensewas established.Thirteen common peaks in the fingerprint were demarcated, four of which were identified by reference substances.Chemical pattern recognition of fingerprint was performed by hierarchical cluster analysis and principal component analysis. Conclusion The method is simple, accurate and has a good repeatability, and can be used for quality control ofDisporumcantoniense.

Disporumcantoniense； Chromatography, high performance liquid； Fingerprint； Similarity； Hierarchical cluster analysis

2014-12-04

2015-01-16

*教育部春晖计划项目(Z2011041)；贵州特色生物资源开发利用重点实验室项目(2012009)

甘秀海(1976-)，男，湖南怀化人，副教授，硕士，研究方向：中药化学及质量控制。电话：0851-85816647，E-mail：gxh200719@163.com。

梁志远(1959-)，女，贵州贵阳人，教授，学士，研究方向：天然产物化学。电话：0851-85816647，E-mail：gzwh24000@sina.com。

R282；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1623-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.019